高聚偉 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科 杭州 310007

潘 磊 陳培豐 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科

龍葵氯仿提取物對人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響

高聚偉 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第三醫(yī)院腫瘤科 杭州 310007

潘 磊 陳培豐 浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院腫瘤科

目的：觀察龍葵氯仿提取物對人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響。方法：設(shè)龍葵氯仿提取物低、中、高三個(gè)劑量組（分別以1mg/mL濃度50、300、500μL加藥）和空白對照組，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)觀察其結(jié)果。結(jié)果：與空白對照組比較，不同劑量的龍葵氯仿提取物作用于A549細(xì)胞24h后，早期凋亡細(xì)胞百分比依次增至4.6%、16.8%和23.6%；晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞百分比依次增至1.1%、1.1%和28.9%。其中龍葵提取物高劑量組，早期凋亡細(xì)胞比例和晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例均明顯高于空白對照組（P＜0.01）。結(jié)論：龍葵氯仿提取物可誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡并呈劑量依賴性；誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死可能是龍葵氯仿提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的主要作用機(jī)制之一。

人肺腺癌 A549細(xì)胞 凋亡 龍葵氯仿提取物

龍葵是茄科（Solanaceae）茄屬植物龍葵（Solanum nigrum Linne）的全草。臨床常用龍葵屬紫莖龍葵，為一年至多年生草本植物。中醫(yī)使用龍葵歷史悠久，認(rèn)為該中藥味苦，性寒、微甘，有小毒；歸肺，腎二經(jīng)。有清熱解毒、活血化瘀、利水消腫、止咳祛痰等功效。近年還發(fā)現(xiàn)該中藥有抗癌作用，被用于治療各種惡性腫瘤。我們前期研究發(fā)現(xiàn)，龍葵氯仿提取物對體外培養(yǎng)的人肝癌HepG2、人肺腺癌A549及人宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖有較明顯的抑制作用，并有一定的量效關(guān)系[1]。本研究觀察龍葵氯仿提取物對人肺腺癌A549細(xì)胞凋亡的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)藥物 龍葵購自浙江中醫(yī)藥大學(xué)附屬第一醫(yī)院中藥房，產(chǎn)地為浙江臨安，經(jīng)該院徐錫山主任藥師鑒定為為茄科(Solanaceae)茄屬(Solanum)植物龍葵（Solanum nigrum L.）的干燥全草。參考文獻(xiàn)[2-3]稱取干燥的龍葵飲片5kg，用8倍量的石油醚80℃提取2h，提取液除菌100℃℃水浴箱濃縮得浸膏，即為龍葵石油醚提取物。將經(jīng)石油醚提取后的龍葵晾干后依次用氯仿、乙酸乙酯、正丁醇、水提取，分別得各自提取物，置4℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

精密稱取龍葵氯仿提取物20mg，溶解于0.5mLDMSO中，旋渦震蕩使其全部溶解，其終濃度均為40mg/mL，置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆?。取龍葵氯仿提取物母?5μL，溶解于75μLDMSO中，旋渦震蕩使其全部溶解，加入900μLRPMI-1640培養(yǎng)液，其終濃度均為1mg/mL，充分混勻后置于-20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 細(xì)胞與細(xì)胞培養(yǎng)[4]人肺腺癌A549細(xì)胞，由浙江中醫(yī)藥大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室提供。分別從-80℃低溫冰箱中取出凍存的A549細(xì)胞，37℃水浴中使其快速融化，1 000rpm/min，5min離心，收集細(xì)胞置于25mL的培養(yǎng)瓶，37℃飽和濕度、5%CO2的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。取對數(shù)期生長的A549細(xì)胞，棄去舊培養(yǎng)液，D-hank’s液清洗兩遍，加入一定量的胰蛋白酶消化5～10min至細(xì)胞皺縮，加入含10%新生牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液終止胰蛋白酶消化，輕輕吹打瓶壁細(xì)胞，收集于試管中，1 000rpm/min，5min離心，棄上清，1:2傳代，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3 試 劑 RPMI-1640：美國GIBCOBRL公司，批號1083956。FCS：杭州四季青生物工程材料研究所，批號20100316。1:250胰蛋白酶：吉泰科技有限公司，批號201004。碘化丙啶（propidium idoide，PI），上海佳和生物科技有限公司。二甲基亞砜（DMSO）：江蘇鴻聲化工廠，批號1128730。Annexin V-EGFP/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測試劑盒：南京碧波生物科技有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)儀器 Heraeus三氣細(xì)胞培養(yǎng)箱：德國Her?aeus公司。倒置熒光顯微鏡：日本OLYMPUS公司。LDS-ZA型低速離心機(jī)：北京醫(yī)用離心機(jī)廠。FACS?Canto流式細(xì)胞儀：美國BD公司。

1.5 方 法 取收集好的A549細(xì)胞，計(jì)數(shù)，傳6孔板，每孔2mL細(xì)胞懸液，待細(xì)胞融合至80%時(shí)加藥，設(shè)龍葵氯仿提取物低、中、高三個(gè)劑量組，分別以1mg/mL濃度50μL（0.05mg/mL）、300μL（0.3mg/mL）、500μL（0.5mg/mL）加藥；同時(shí)設(shè)空白對照組，不加藥。24h后凋亡檢測，根據(jù)細(xì)胞凋亡檢測試劑盒說明操作：①在進(jìn)行完細(xì)胞凋亡刺激后，1 000rpm離心5min，棄上清，收集細(xì)胞，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計(jì)數(shù)。②?。?～5）×105重懸的細(xì)胞，1 000rpm離心5min，棄上清，加入500μL結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。③加入5μL Annexin V-EGFP，輕輕混勻；再加入5μL碘化丙啶，輕輕混勻。④室溫（20-25℃）避光孵育10min（使用鋁箔進(jìn)行避光）。⑤隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，百分比用%表示，率的比較用Fisher確切概率法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

不同劑量的龍葵氯仿提取物作用于A549細(xì)胞24h后，早期凋亡細(xì)胞（右下象限B4，Annexin V+/ PI-）的凋亡率，高、中劑量組分別為16.8%、23.6%，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；而低劑量組凋亡率為4.6%，與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞（右上象限B2，Annexin V+/PI+）的凋亡率高劑量組為28.9%，與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）；中、低劑量組凋亡率均為1.1%，與空白對照組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。活細(xì)胞（左下象限B3，Annexin V-/PI-）的凋亡率，空白對照組為98.6%，而高、中、低劑量組分別為47.5%、82.1%和94.3%，其中高、中劑量組與空白對照組比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。細(xì)胞收集過程中產(chǎn)生的損傷細(xì)胞（左上象限B1，Annexin V-/PI+），各用藥組與空白對照組比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表1、圖1。

3 討論

細(xì)胞凋亡（apoptosis）指細(xì)胞在生長、發(fā)育和分化過程中，由基因調(diào)控產(chǎn)生的細(xì)胞自主、有序的主動性自發(fā)死亡現(xiàn)象，是生理性細(xì)胞死亡的主要方式，故又稱程序性細(xì)胞死亡（programmed cell death，PCD）[5]。自從細(xì)胞凋亡概念提出后，目前凋亡研究已滲透到生物學(xué)、基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)、臨床治療和藥物篩選等許多領(lǐng)域，特別是凋亡與腫瘤發(fā)病機(jī)制及腫瘤治療研究已成為當(dāng)今醫(yī)學(xué)界腫瘤研究的熱點(diǎn)之一。人們認(rèn)識到腫瘤的發(fā)生發(fā)展是由于腫瘤細(xì)胞的生長與凋亡失衡造成的，因此，誘導(dǎo)凋亡也可作為腫瘤療效評價(jià)的一項(xiàng)指標(biāo)[6-9]。

本研究在前期研究的基礎(chǔ)上，運(yùn)用流式細(xì)胞術(shù)檢測不同濃度龍葵氯仿提取物對人肺腺癌A549細(xì)胞的凋亡的影響，對其抗腫瘤機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步的探討。結(jié)果顯示，與空白對照組比較，不同劑量（50μL、300μL、500μL）的龍葵氯仿提取物作用于A549細(xì)胞24h后，早期凋亡細(xì)胞百分比依次增至4.6%、16.8%和23.6%；晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞百分比依次增至1.1%、1.1%和28.9%。其中龍葵提取物高劑量組，其早期凋亡細(xì)胞比例和晚期凋亡細(xì)胞及壞死細(xì)胞比例均明顯高于空白對照組（P＜0.01）。這些結(jié)果表明，龍葵氯仿提取物能誘導(dǎo)A549細(xì)胞凋亡并呈劑量依賴性。故誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡和壞死可能是龍葵氯仿提取物抑制腫瘤細(xì)胞增殖的主要機(jī)制之一。

［1］高聚偉.龍葵氯仿及正丁醇提取物時(shí)Lewis肺癌小鼠移植瘤作用及其機(jī)理研究［D］.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，2012.

［2］謝秀瓊.中藥新制劑開發(fā)與應(yīng)用［M］.第3版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2006：70-71.

［3］盧艷花.中藥有效成分提取分離技術(shù)［M］.第2版.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2008：2-7.

［4］司徒鎮(zhèn)強(qiáng)，吳正軍.細(xì)胞培養(yǎng)［M］.第2版.北京：世界圖書出版公司，2007：19.

［5］成軍.程序性細(xì)胞死亡與疾?。跰］.北京：北京醫(yī)科大學(xué)中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué)聯(lián)合出版社，1997：101-120.

［6］Marx J.Cell death studies yield cancer clues［J］.Science，1993，259（5096）:760-761.

［7］Kerr JF,Winterford CM,Harmon BV.Apoptosis:its signifi?cance in cancerand cancer therapy［J］.Cancer，1994，73（8）: 2013-2026.

［8］Altieri DC.Survivin,versatilemodulation of cell division and apoptosis in cancer［J］.Oncogene，2003，22（53）:8581-8589.

［9］Tsuda H,Sata M,Ijuuin H，et al.A novel strategy for remis?sion induction and maintenance in cancer therapy［J］.Oncol Rep，2002，9（1）:65-68.

Influence of Chloroform Extract from Solanum nigrum L on Human Lung Adenocarcinoma A549 Cell Apoptosis

GAO Juwei，PAN Lei，CHEN Peifeng.Department of Oncology,the Third Affiliated Hospital of Zheji?ang Chinese Medical University,Hangzhou(310007),China

Objective:To observe the influence of chloroform extract from Solanum nigrum L on human lung ade?nocarcinoma A549 cell apoptosis.Methods:Low,middle,and high dosage groups of chloroform extract from Sola?num nigrum L(50,300,and 500μg)and control groups were set and flow cytometry was used to observe cell apoptosis.Results:Compared with the control group,after being treated with different dosages of chloroform ex?tract from Solanum nigrum L,the percentage of early apoptotic A549 cells increased to 4.6%,16.8%,and 23.6%, and the percentage of late apoptotic cells/necrotic cells increased to 1.1%,1.1%,and 28.9%.A significant dif?ference in the percentages of cell apoptosis was noted between the high dosage group of chloroform extract from Solanum nigrum L and the control group(P＜0.01).Conclusion:Chloroform extract from Solanum nigrum L can induce apoptosis of A549 cells,and showed a dose-effect relationship.Induction of tumor cell apoptosis and ne?crosis may be one of the main mechanisms of the extract on inhibiting proliferation of tumor cells.

human lung adenocarcinoma A549 cell apoptosis chloroform extract from Solanum nigrum L

2012-12-12

浙江省中醫(yī)藥管理局資助項(xiàng)目（No.A210907）

陳培豐，Tel：0571-87072196；E-mail：CPF12345@163.com