丁常宏，都曉偉，徐瑩

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

真核生物一般約有10萬(wàn)個(gè)基因，而在單個(gè)細(xì)胞中，僅有約15%的基因可以表達(dá)?；虻倪x擇表達(dá)，決定著整個(gè)生命過(guò)程中的發(fā)育、分化、應(yīng)激反應(yīng)、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、細(xì)胞周期調(diào)控等。基因的這種差異表達(dá)不僅受生物體內(nèi)在機(jī)制的調(diào)控，也受外界環(huán)境因素，如光照、溫度、逆境、藥物作用等的影響。如何有效地分離并克隆在不同處理?xiàng)l件下、不同發(fā)育階段或不同細(xì)胞群體間差異表達(dá)的基因，是分子生物學(xué)研究的一大熱點(diǎn)。目前，分離克隆差異顯示基因的方法主要有扣除雜交(subtractive hybridiza－tion)、mRNA差別顯示(mRNA differential display reverse transcription，DDRT－PCR)、基因表達(dá)系列分析(serial analysisof gene expression，SAGE)、代表性差異分析(representational difference analysis of cDNA，cDNARDA)、抑制性扣除雜交(sup－pression subtractive hybridization)、RFLP與區(qū)域定向差異技術(shù)偶聯(lián)的DDRT－PCR(RFLP－Coupled domaindirected display，RC4D)、cDNA － AFLP、基因芯片等。其中由Liang等發(fā)明的DDRT－PCR因?yàn)榫哂泻?jiǎn)便、快速、高效、所需RNA量少等優(yōu)點(diǎn)而被廣泛用于真核生物基因差異表達(dá)的研究和差異表達(dá)基因的分離克?。?］。這里綜述了該技術(shù)的原理，并簡(jiǎn)要介紹了其在中藥學(xué)研究中的應(yīng)用。

1 DDRT－PCR技術(shù)基本原理

mRNA差異顯示技術(shù)(mRNA differential display reverse transcription PCR，DDRT－PCR)是一種比較不同細(xì)胞系、不同組織間，或同一細(xì)胞系、同一組織不同條件下基因表達(dá)差異的技術(shù)方法。該技術(shù)可分為三個(gè)基本步驟。第一步RNA的提取及反轉(zhuǎn)錄:分別提取兩種或多種材料中的總RNA或mRNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA。第二步PCR擴(kuò)增:利用cDNA3'端錨定引物和5'端隨機(jī)引物組成引物對(duì)，在較低退火溫度下(32～42℃)擴(kuò)增生成cDNA。第三步分離比較擴(kuò)增產(chǎn)物:利用高分辨率的聚丙烯酰胺凝膠電泳，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行分離，由于擴(kuò)增的cDNA片段被放射性同位素或熒光素標(biāo)記，通過(guò)自顯影或顯色技術(shù)，即可獲得差異表達(dá)基因擴(kuò)增的條帶，但大多數(shù)情況下，以方便、節(jié)約為目的，利用銀染技術(shù)顯示差異條帶，在相鄰泳道上比較基因表達(dá)的差異［2］。

與傳統(tǒng)的方法相比，DDRT－PCR技術(shù)能夠快速地顯示mRNA的組成，可同時(shí)對(duì)比多個(gè)樣本mRNA的差異，擴(kuò)增的cDNA可以用來(lái)測(cè)序、亞克隆及用作探針篩選文庫(kù)。并且由于PCR擴(kuò)增技術(shù)的運(yùn)用，可同時(shí)獲得高豐度和低豐度表達(dá)的基因。當(dāng)然DDRT－PCR技術(shù)也存在假陽(yáng)性多、特異性cDNA片段短、擴(kuò)增傾向高豐度mRNA等不足。目前許多學(xué)者對(duì)DDRT－PCR技術(shù)進(jìn)行了改進(jìn):如從引物的長(zhǎng)度、組合的數(shù)目、堿基的組成方面進(jìn)行改進(jìn);通過(guò)優(yōu)化PCR循環(huán)參數(shù)來(lái)提高DDRT－PCR技術(shù)的重復(fù)性、明顯降低假陽(yáng)性率;通過(guò)扣除雜交、巢式引物重?cái)U(kuò)增cDNA片段等方面來(lái)降低假陽(yáng)性;在從聚丙烯酰胺凝膠上切取差異條帶時(shí)，選取相互對(duì)照組的各組間信號(hào)強(qiáng)度對(duì)比明顯的條帶，當(dāng)在切下的一條帶中可能含有幾條cDNA片斷時(shí)可用單鏈構(gòu)象多態(tài)性(SSCP)方法區(qū)分開(kāi)來(lái);用反向Northern點(diǎn)雜交檢測(cè)陽(yáng)性克隆可大大減少工作量;也有用Real Time－PCR的方式來(lái)鑒定差異片段的方法，去除假陽(yáng)性的困擾，無(wú)論從準(zhǔn)確性還是減少工作量方面都有了較多的改進(jìn)。

2 DDRT－PCR在中藥研究中的應(yīng)用

DDRT－PCR技術(shù)已成為分析基因差異表達(dá)、分離和克隆差異表達(dá)基因的有力工具。這項(xiàng)技術(shù)近年十年來(lái)已開(kāi)始在植物、動(dòng)物、微生物［3］研究中應(yīng)用。目前在生物的基因表達(dá)［4］、基因的鑒定與克?。?－6］、植物抗性［7］、環(huán)境脅迫［8－9］、病理［10］等方面已有成功報(bào)道。但在中藥研究中應(yīng)用的例子還不多，但已顯示出極強(qiáng)的可塑性和應(yīng)用性。

2.1 中藥作用機(jī)制的研究

DDRT－PCR技術(shù)可以比較同一種組織或細(xì)胞在使用某種中藥或中藥活性成分處理后所引發(fā)的基因差異表達(dá)，篩選差異表達(dá)基因，以此來(lái)研究該中藥或其活性成分對(duì)細(xì)胞行為的影響。DDRT－PCR可以從基因表達(dá)的水平入手，研究特定細(xì)胞(靶細(xì)胞)在mRNA水平上藥物的干預(yù)情況，所以可以更全面揭示藥物的作用機(jī)制，更好地闡明中藥的多環(huán)節(jié)、多靶點(diǎn)的作用方式。

苦參堿可用于人白血病的治療，何於娟等［11］應(yīng)用改良的DDRT－PCR技術(shù)研究苦參堿誘導(dǎo)人紅白血病K562細(xì)胞分化的分子機(jī)制，得出苦參堿能誘導(dǎo)K562細(xì)胞基因表達(dá)譜發(fā)生變化，而且此過(guò)程是一個(gè)多基因參與的過(guò)程。郝崗平等［12］用DDRT－PCR方法研究發(fā)現(xiàn)丹參注射液處理動(dòng)脈粥樣硬化大鼠，會(huì)使其胸主動(dòng)脈細(xì)胞發(fā)生一些基因表達(dá)水平發(fā)生變化，減弱血管內(nèi)皮細(xì)胞發(fā)生的病理變化，從而阻礙動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的形成。王澤平等［13］用泰山赤靈芝多糖注射液處理動(dòng)脈粥樣硬化大鼠，觀察其血脂的變化，并利用DDRT－PCR技術(shù)篩選大鼠胸主動(dòng)脈細(xì)胞用藥前后差異表達(dá)的基因，了解到泰山赤靈芝多糖治療動(dòng)脈粥樣硬化、降低血脂的分子機(jī)制。GY Shi等［14］利用DDRT－PCR技術(shù)研究了長(zhǎng)春瑞濱和多烯紫杉醇作用于人肺癌細(xì)胞株時(shí)引發(fā)的基因表達(dá)差異，以探索兩種抗腫瘤藥物的治病機(jī)理。

2.2 中藥復(fù)方作用機(jī)制的研究

中藥復(fù)方成分復(fù)雜，且各種成分含量極微，它對(duì)機(jī)體的調(diào)控作用是多靶點(diǎn)、多環(huán)節(jié)的，至今很多中藥復(fù)方的作用機(jī)制仍不明確。傳統(tǒng)的方法往往從全方或拆方的角度得到一些片面或表面的結(jié)論，不能深入發(fā)掘中藥復(fù)方的作用機(jī)制，也很難顧及中藥復(fù)方的復(fù)雜性和整體性。血清藥物化學(xué)、分子生物學(xué)等可以對(duì)中藥復(fù)方進(jìn)行整體把握的現(xiàn)代手段逐漸被應(yīng)用并取得了階段性的進(jìn)展。其中DDRT－PCR技術(shù)就可以了解復(fù)方對(duì)整個(gè)細(xì)胞基因表達(dá)情況的影響，通過(guò)各自不同的表達(dá)譜，比較研究不同配伍組方對(duì)應(yīng)的基因表達(dá)靶點(diǎn)，并可根據(jù)表達(dá)水平與復(fù)方的君、臣、佐、使理論及用藥劑量相關(guān)性，闡明藥物作用的物質(zhì)基礎(chǔ)及其內(nèi)在配伍規(guī)律。

近年來(lái)的研究工作主要表現(xiàn)在通過(guò)比較復(fù)方對(duì)細(xì)胞基因表達(dá)譜的影響，鑒別差異表達(dá)的基因，從而尋找復(fù)方作用的靶基因并推測(cè)中藥復(fù)方作用的分子機(jī)制及內(nèi)在規(guī)律。柴立民等［15］利用DDRT－PCR技術(shù)分析在益髓生血顆粒治療前后，β－珠蛋白生成障礙性貧血患兒骨髓有核細(xì)胞的基因表達(dá)差異。發(fā)現(xiàn)治療3個(gè)月后患兒的鐵蛋白基因表達(dá)明顯降低，這有效緩解了患兒體內(nèi)鐵的蓄積，推測(cè)可能是益髓生血顆粒治療β－珠蛋白生成障礙性貧血病的分子機(jī)制之一。

馬宇漠等［16］利用DDRT－PCR技術(shù)研究用健骨沖劑對(duì)去勢(shì)大鼠處理后，其骨組織中基因的差異表達(dá)。共篩選出10條有差異表達(dá)的基因片段，其中2條為透明質(zhì)酸調(diào)節(jié)的運(yùn)動(dòng)受體(RHAMM)和Na+－K+－ATP轉(zhuǎn)運(yùn)酶β3亞單位(ATPlb3)的mRNA片段。而且這兩個(gè)片段在健骨沖劑作用后表達(dá)分別下降和上調(diào)。張沖等［17］利用DDRT－PCR技術(shù)探索補(bǔ)腎益腦片對(duì)快速衰老小鼠的生理及其腦組織基因表達(dá)的影響，得到14個(gè)差異表達(dá)條帶，發(fā)現(xiàn)其中的3個(gè)條帶的序列分別與脂肪酸結(jié)合蛋白－7、還原型輔酶Q－細(xì)胞色素c還原酶復(fù)合體7.2kD亞單位及核糖體大亞基的第21亞單位的mRNA序列同源。同源性分別達(dá)到97%、100%、99%。從而得出補(bǔ)腎益腦片抗衰老功效的發(fā)揮可以通過(guò)調(diào)節(jié)小鼠腦組織基因表達(dá)水平來(lái)實(shí)現(xiàn)。楊婷等［18］應(yīng)用DDRT－PCR技術(shù)研究補(bǔ)腎益腦片提取物作用后，SAM P10/Ta小鼠原代培養(yǎng)的神經(jīng)細(xì)胞基因表達(dá)的變化情況。共發(fā)現(xiàn)了10個(gè)差異片段，通過(guò)分析鑒定認(rèn)為補(bǔ)腎益腦片抗衰老作用的發(fā)揮可能通過(guò)影響與衰老相關(guān)的基因表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)。

2.3 中藥植物生物學(xué)的研究

藥用植物是中藥來(lái)源和質(zhì)量的基礎(chǔ)保障，對(duì)于藥用植物的生物學(xué)研究有助于對(duì)其發(fā)育生物學(xué)的各項(xiàng)特征和藥理、藥效方面特征的把握，有利于提高中藥材的質(zhì)量和產(chǎn)量。近十幾年來(lái)，將DDRT－PCR技術(shù)應(yīng)用于藥用植物生物學(xué)的研究也收獲了較多成果。

M Kakinuma等［19］利用 DDRT－PCR 技術(shù)研究了熱和鹽脅迫下孔石莼不育突變體生理生化的改變。J Xu等［20］利用DDRT－PCR技術(shù)研究鑒定了龍葵幼苗鎘應(yīng)答的基因。盛瑋等［21］利用DDRT－PCR技術(shù)，分離并克隆半夏試管小塊莖發(fā)育過(guò)程中表達(dá)的相關(guān)基因片段，得到15個(gè)特異表達(dá)的cDNA片段。通過(guò)同源性比照發(fā)現(xiàn)其中6個(gè)在GeneBank中沒(méi)有與之匹配的同源序列，可能為新的cDNA片斷。3個(gè)片段分別與真核生物啟動(dòng)子、MADS－box蛋白及乙烯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)因子具有較高的同源性，并在半夏塊莖形成不同天數(shù)高度特異表達(dá)。李標(biāo)等［22］利用DDRT－PCR技術(shù)研究瘤菌屬菌根真菌AR－18促進(jìn)藥用植物福建金線蓮生長(zhǎng)發(fā)育的分子作用機(jī)制，運(yùn)用重?cái)U(kuò)增、反式Northern點(diǎn)雜交等篩選，發(fā)現(xiàn)5條上調(diào)表達(dá)基因，其中包括編碼尿磷酸核苷轉(zhuǎn)移酶基因(UPRTs;EC2.4.2.9)、編碼氨基酸跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)子的基因、編碼突變酶K(matK)的基因等，并討論了差異表達(dá)基因的功能。

3 展望

DDRT－PCR技術(shù)在1992年建立以來(lái)，一直受到其他技術(shù)如基因芯片、抑制消減雜交等的挑戰(zhàn)，而且其自身也存在一定的缺陷。但隨著其實(shí)驗(yàn)技術(shù)的不斷改進(jìn)和完善，高效試劑盒的出現(xiàn)，使這項(xiàng)技術(shù)在生物新基因的分離與克隆、基因差異表達(dá)等方面的使用頻率越來(lái)越高，尤其是對(duì)于僅有少量樣品和要對(duì)多種不同處理進(jìn)行比較的情況下，DDRT－PCR仍然是目前篩選差異表達(dá)基因最有效的方法。在中藥的研究中，DDRT－PCR技術(shù)也可以在以下方面發(fā)揮重要作用。

3.1 中藥材的作用機(jī)理分析 現(xiàn)在關(guān)于這方面已有一些相關(guān)的研究，并取得了一定的進(jìn)展，但仍有相當(dāng)大的發(fā)展空間和較多的研究方向。如果能利用mRNA的差異表達(dá)分析中藥作用后細(xì)胞或組織在基因水平上的改變與調(diào)節(jié)，清楚了解中藥最本質(zhì)的作用機(jī)理，相信定能幫助中藥材更好的走向世界。

3.2 增強(qiáng)藥用植物的抗性 中藥材講究綠色天然，對(duì)于其栽培過(guò)程中施加的農(nóng)藥和肥料都有一定的要求，正因如此中藥材的病蟲害防治問(wèn)題常令人困擾。如今DDRT－PCR技術(shù)在植物抗性基因的鑒定與克隆方面已取得了很多研究成果［7］，如果有比Bt、Ht等基因更安全有效的抗性基因可以轉(zhuǎn)入中藥植物中，必將為中藥材的安全性做出更大的貢獻(xiàn)。

3.3 道地藥材形成機(jī)理的研究 地道藥材在分子方面的研究往往只局限在應(yīng)用AFLP、RFLP、RAPD、SSR、ISSR、SNP等分子標(biāo)記技術(shù)上。筆者認(rèn)為，在基因差異的層次之上，更有必要對(duì)其表達(dá)水平進(jìn)行研究，因?yàn)榛蛲ǔＪ潜磉_(dá)之后才彰顯其作用的。如果分析清楚相同時(shí)期道地藥材和非道地藥材在表達(dá)水平上的差異，可能對(duì)道地藥材形成機(jī)理的研究會(huì)有很大的幫助。

3.4 藥用植物與內(nèi)生真菌相互作用機(jī)理的研究

1993年美國(guó)蒙大拿州立大學(xué)Strobel小組首次從短葉紅豆杉(Taxus brevifolian)中分離得到一株能合成抗癌物質(zhì)紫杉醇的內(nèi)生真菌，至今，人們已先后從近百種藥用植物中分離得到了多種內(nèi)生菌，并利用內(nèi)生菌發(fā)酵促進(jìn)藥用植物或藥材產(chǎn)生了某些重要的天然活性成分。但對(duì)于藥用植物和其內(nèi)生真菌相互作用的機(jī)理尚未明確的闡述，DDRT－PCR可以幫助我們從基因表達(dá)的水平上做一探求。

除了以上幾個(gè)方面DDRT－PCR技術(shù)還在藥理研究、復(fù)方配伍等方面為中藥的研究開(kāi)辟了新的思路和途徑?？梢韵嘈牛S著人們認(rèn)識(shí)的深入和DDRT－PCR技術(shù)的完善和普及，DDRT－PCR將在中藥的研究中發(fā)揮更為重要的作用。

［1］王新超，梅菊芬，楊亞軍.mRNA差異顯示技術(shù)在植物學(xué)領(lǐng)域的應(yīng)用［J］.浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，2008，20(2):144 －148.

［2］王建暉，侯學(xué)文.基于mRNA水平的差異表達(dá)基因篩選技術(shù)［J］.生物學(xué)雜志，2009，26(4):77 －81.

［3］劉紅芳，席麗艷.差異顯示逆轉(zhuǎn)錄PCR技術(shù)在醫(yī)學(xué)真菌研究中的應(yīng)用［J］.國(guó)際皮膚性病學(xué)雜志，2006，32(2):87 －89.

［4］Zhang JF，Turley RB，Stewart JM.Comparative analysis of gene expression between CMS－D8restored plants and normal non－restoring fertile plants in cotton by differential display［J］.Plant Cell Reports，2008，27(3):553 －561.

［5］Tan YP，Lu Q，Li LR，et al.Molecular cloning and tissue transcriptional analysis of a novel gene encoding proteasome activator PA28－a from common carp(Cyprinus carpio L.)［J］.Fisheries Science，2010，76(3):511－519.

［6］Y Okada，S Miyazaki，S Koshikawa，et al.Identification of a reproductive－specific，putative lipid transport protein gene in a queenless ponerine antDiacammasp［J］.Naturwissenschaften，2010，97(11):971－979.

［7］谷守芹，解靈君，范永山.DDRT－PCR技術(shù)及其在植物抗性相關(guān)基因分離克隆中的應(yīng)用［J］.河北林果研究，2005，20(2):138－142.

［8］Wang Y，Huang J，Gou BC，et al.Cloning and characterization of a differentially expressed cDNA encoding myo－inositol－1－phosphate synthase involved in response to abiotic stress in Jatropha curcas［J］.Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2011，106(2):269 －277.

［9］Qin L，Zhang LC，Zhang B.Differential Gene Expression in Leaves and Roots of Winter Rape in Response to Phosphorus Starvation［J］.Russian Journal of Plant Physiology，2011，58(1):142 －148.

［10］Nagai MA，JHTG.Fregnani，MM Netto，et al.Down － regulation of PHLDA1 gene expression is associated with breast cancer progression［J］.Breast Cancer Res Treat，2007，106(1):49 －56.

［11］何於娟，蔣紀(jì)愷，張彥，等.苦參堿誘導(dǎo)K562細(xì)胞分化的差異表達(dá)基因的研究［J］.中草藥，2005，36(2):224 －228.

［12］郝崗平，史仁玖，張媛英.丹參注射液處理動(dòng)脈粥樣硬化大鼠前后胸主動(dòng)脈細(xì)胞相關(guān)基因表達(dá)的變化［J］.中國(guó)臨床康復(fù)，2005，9(30):98－100.

［13］王澤平，顧洪雁，伊淑瑩.泰山赤靈芝多糖緩解大鼠動(dòng)脈粥樣硬化的分子機(jī)制研究［J］.中國(guó)病理生理雜志，2009，25(12):2310－2313.

［14］GY Shi，L Cai，W Jiang，et al.Effects of Navelbine and Docetaxel on Gene Expression in Human Lung Cancer Cell Lines［J］.Cell Biochemistry and Biophysics，2011，61(3):665 －671.

［15］柴立民，吳志奎，張新華，等.中藥益髓生血顆粒對(duì)β－珠蛋白生成障礙性貧血患兒基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25(7):591 －594.

［16］馬宇漠，張新民，李世峰，等.健骨沖劑對(duì)去勢(shì)大鼠骨組織基因差異表達(dá)影響的研究［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2005，25(2):138－142.

［17］張沖，王娜剛，楊婷，等.補(bǔ)腎益腦片對(duì)快速衰老小鼠生理及腦組織基因表達(dá)的影響［J］.中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26(S1):24－30.

［18］楊婷，張沖，何新，等.補(bǔ)腎益腦片對(duì)加速衰老小鼠P10/Ta小鼠神經(jīng)細(xì)胞衰老相關(guān)基因表達(dá)的調(diào)節(jié)［J］.中國(guó)藥學(xué)雜志，2007，42(6):427－432.

［19］M Kakinuma，D A Coury，Y Kuno，et al.Physiological and biochemical responses to thermal and salinity stresses in a sterile mutant of Ulva pertusa(Ulvales，Chlorophyta)［J］.Marine Biology，2006，149(1):97－106.

［20］J Xu，H X Yin，W Y Wang，et al.Identification of Cd － Responsive Genes of Solanum nigrum Seedlings Through Differential Display［J］.Plant Molecular Biology Reporter，2009，27(4):563 － 569.

［21］盛瑋，張愛(ài)民，黃月琴，等.半夏試管小塊莖發(fā)育過(guò)程中相關(guān)基因差異表達(dá)的研究［J］.中國(guó)中藥雜志，2011，36(3):316 －320.

［22］李標(biāo)，唐明娟，唐坤，等.與菌根真菌共生的蘭科福建金線蓮差異表達(dá)基因的篩選［J］.中國(guó)科學(xué):生命科學(xué)，2012，42(3):218－225.