曾 琨 成洪波 應(yīng)方微

（深圳市眼科醫(yī)院，廣東 深圳 518040）

人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定

曾 琨 成洪波 應(yīng)方微

（深圳市眼科醫(yī)院，廣東 深圳 518040）

目的 分析對(duì)人 Tenon's 囊成纖維細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)與鑒定的優(yōu)良方法。方法 實(shí)驗(yàn)選擇白內(nèi)障手術(shù)患者中的結(jié)膜 Tenon 囊組織塊，培養(yǎng)成纖維細(xì)胞，選擇第 5～9 代細(xì)胞，放置于培養(yǎng)皿中，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，等待細(xì)胞成長(zhǎng)至 70%～80% 的亞融合狀態(tài)后按照濃度分別為 TGF-β1(0μg/L，2μg/L，5μg/L，10μg/L，20μg/L)、靜置時(shí)間為 (24h、48h、72h)進(jìn)行不同程度誘導(dǎo)，實(shí)現(xiàn)纖維細(xì)胞表向肌成纖維細(xì)胞的轉(zhuǎn)換。結(jié)果 對(duì)所選人Tenon 囊組織塊進(jìn)行 5～7d 的貼壁培養(yǎng)后，觀察細(xì)有梭形 HTF 長(zhǎng)出，再經(jīng)過(guò) 1 ∶ 2 的傳代增值后，大約 3～4d 后培養(yǎng)器皿整個(gè)瓶底便會(huì)長(zhǎng)滿，大約 5d 時(shí)間 HTF 可實(shí)現(xiàn)匯合狀態(tài)。HTF 放置 24h 之后 (TGF-β1為 0μg/L)也沒(méi)有著色反應(yīng)，即為陰性。采用濃度分別為 2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L TGF-β1對(duì) HTF 進(jìn)行誘導(dǎo) 24h 之后，α-SMA 出現(xiàn)了紫紅色著色現(xiàn)象，變現(xiàn)為陽(yáng)性。結(jié)論 通過(guò)對(duì)原代培養(yǎng) HTF 進(jìn)行多次傳代后，發(fā)現(xiàn)原第3～5代細(xì)胞具有較強(qiáng)的活力，并且傳代后的細(xì)胞增殖能力比較穩(wěn)定，可作為醫(yī)學(xué)界開展濾過(guò)泡抗纖維化研究的優(yōu)良靶細(xì)胞。

纖維細(xì)胞；培養(yǎng)；鑒定

青光眼為一種不可逆的且可導(dǎo)致患者失明的危害性極大的眼病，全球范圍內(nèi)可排第 2 位，目前臨床上對(duì)于青光眼的治療方法中以濾過(guò)手術(shù)最為常見(jiàn)，主要因?yàn)闉V過(guò)手術(shù)對(duì)于降低眼壓的效果比較明顯。然而，濾過(guò)手術(shù)的成功率不高，雖然隨著醫(yī)學(xué)技術(shù)的不斷改進(jìn)，手術(shù)方式也得到了改善，并且在術(shù)后采用了較好的抗代謝類藥物，現(xiàn)階段濾過(guò)手術(shù)仍然存在15%～25%的失敗率[1]。主要是因?yàn)槭中g(shù)做完之后濾過(guò)泡的出現(xiàn)痕化不利于患者康復(fù)。目前對(duì)于濾過(guò)手術(shù)后出現(xiàn)的泡瘢痕的形成原理仍在進(jìn)一步探討和研究中，現(xiàn)有的文獻(xiàn)資料認(rèn)為病理性瘢痕的產(chǎn)生與修復(fù)細(xì)胞（以成纖維細(xì)胞為主）的大批量的繁殖與死亡抑制、合成細(xì)胞外基質(zhì)（ECM）與降解失衡以及產(chǎn)生大量部分細(xì)胞因子有著極為密切關(guān)聯(lián)。此外以上環(huán)節(jié)要想順利展開都是建立在人Tenon囊成纖維細(xì)胞（HTF）的重要基礎(chǔ)之上。如此看來(lái)，要想更好的對(duì)抗濾過(guò)泡瘢痕化展開進(jìn)一步的研究，關(guān)鍵在于能否培養(yǎng)出HTF，并對(duì)該細(xì)胞的經(jīng)過(guò)多代繁殖后細(xì)胞活力與增值能力是否依然穩(wěn)定進(jìn)行深入了解，進(jìn)而為有效的開展泡瘢痕的形成機(jī)制研究提供數(shù)據(jù)參考。

1 資料與方法

1.1 樣本來(lái)源

選擇眼科門診部收治的白內(nèi)障手術(shù)患者中6例，所取的Tenon囊組織，其中男性患者和女性患者各3例，年齡分布為37～75歲，患者平均年齡為65歲。每位患者手術(shù)中所取組織都為4mm×6mm，厚度為1mm左右。對(duì)于手術(shù)中所取材料全部進(jìn)行單獨(dú)培養(yǎng)HTF，n=6。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

采用醫(yī)學(xué)報(bào)道資料中的組織貼塊法對(duì)所選細(xì)胞原進(jìn)行單獨(dú)代培養(yǎng)。將人Tenon囊組織放置在DMEM培養(yǎng)液當(dāng)中，將結(jié)締組織與血跡采用直鑷分離法完全分離開，隨后把Tenon囊組織剪切成規(guī)格為1mm× 1mm左右的組織塊，并將剪切好的組織塊放置于培養(yǎng)皿（Coring Ltd）里面，然后在培養(yǎng)皿中放入DMEM培養(yǎng)液（含20%胎牛血清），開始完成貼壁培養(yǎng)。觀察細(xì)胞成長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞變?yōu)槿诤蠣顟B(tài)后，采用0.25%胰蛋白酶（Trypsin-EDTA）消化、傳代至75mL培養(yǎng)瓶（Corning Ltd）[2]。

1.2.2 標(biāo)本的制備

實(shí)驗(yàn)選擇第5～9代細(xì)胞，將所選細(xì)胞放置于培養(yǎng)皿中，進(jìn)行貼壁培養(yǎng)，等待細(xì)胞成長(zhǎng)至70%～80%的亞融合狀態(tài)后，將細(xì)胞放置于3mLDMEM培養(yǎng)液中觀察48h。然后將部分培養(yǎng)皿中的DMEM培養(yǎng)液吸棄，最終濃度依次為：0μg/L、2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/ L的TGF-β1實(shí)行24h誘導(dǎo)；將剩余部分培養(yǎng)皿根據(jù)誘導(dǎo)進(jìn)行重新分組，最終濃度為10μg/L的TGF-β1誘導(dǎo)時(shí)間分別為24h、48h、72h。對(duì)照組細(xì)胞全部實(shí)行貼壁培養(yǎng)達(dá)待細(xì)胞成長(zhǎng)至70%～80%亞融合狀態(tài)后，放置于培養(yǎng)皿中靜置48h。

1.2.3 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化鑒定

采用免疫細(xì)胞的化學(xué)技術(shù)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行技術(shù)鑒定，對(duì)于所有誘導(dǎo)完成后的HTF懸液以及陽(yáng)性對(duì)照人選取的平滑肌細(xì)胞進(jìn)行鑒定，一抗選用鼠抗α-SMA單克隆抗體比例為1∶100，空白對(duì)照組未采用一抗；二抗則選擇堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗鼠IgG比例為1∶200；采用TBS 1∶50稀釋之后，NBT/BCP染色試劑盒出現(xiàn)顏色，采用常規(guī)型透明脫水；使用中性樹脂封片進(jìn)行保存[3]。

2 結(jié) 果

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)情況

對(duì)所選人Tenon囊組織塊進(jìn)行5～7d的貼壁培養(yǎng)后，觀察細(xì)胞有梭形HTF長(zhǎng)出，再經(jīng)過(guò)1∶2的傳代增值后，大約3～4d后培養(yǎng)器皿整個(gè)瓶底便會(huì)長(zhǎng)滿，大約5d時(shí)間HTF可實(shí)現(xiàn)匯合狀態(tài)。

2.2 細(xì)胞表型鑒定

經(jīng)過(guò)免疫細(xì)胞的化學(xué)技術(shù)檢測(cè)后觀察到：α-SMA在與陽(yáng)性對(duì)照hVSMC后出現(xiàn)了深紫紅色陽(yáng)性染色。而免疫組細(xì)胞在未加一抗時(shí)，HTF對(duì)照為陰性，沒(méi)有著色。將HTF放置24h之后（TGF-β1為0μg/ L）也沒(méi)有著色反應(yīng)，即為陰性。采用濃度分別為2μg/L、5μg/L、10μg/L、20μg/L TGF-β1對(duì)HTF進(jìn)行誘導(dǎo)24h之后，α-SMA出現(xiàn)了紫紅色著色現(xiàn)象，變現(xiàn)為陽(yáng)性。

3 討 論

目前臨床上治療青光眼主要采用濾過(guò)手術(shù)，然而慮過(guò)手術(shù)的失敗率高達(dá)15%～25%，經(jīng)過(guò)醫(yī)學(xué)研究分析得知，濾過(guò)泡瘢痕化是造成濾過(guò)手術(shù)失敗的主要原因，而Tenon囊成纖維細(xì)胞在濾過(guò)泡瘢痕化的形成中起到了關(guān)鍵性作用，因此研究人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)和鑒定具有重要意義。經(jīng)分析，目前國(guó)內(nèi)外醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中所使用的HTF大部分都是通過(guò)組織塊法對(duì)原代進(jìn)行再培養(yǎng)后取得的。成纖維細(xì)胞獲得的倍增時(shí)間相對(duì)來(lái)說(shuō)較短，分化潛力很強(qiáng)，體外增值迅速，對(duì)于抗濾過(guò)泡纖維化進(jìn)行科學(xué)研究時(shí)多選擇將HTF作為靶細(xì)胞，目的在于通過(guò)抑制細(xì)胞實(shí)現(xiàn)對(duì)濾過(guò)泡瘢痕化產(chǎn)生抑制作用。本研究證實(shí)，通過(guò)對(duì)原代培養(yǎng)HTF進(jìn)行多次傳代后，發(fā)現(xiàn)原第3～5代細(xì)胞具有較強(qiáng)的活力，并且傳代后的細(xì)胞增殖能力比較穩(wěn)定，可作為醫(yī)學(xué)界開展濾過(guò)泡抗纖維化研究的優(yōu)良靶細(xì)胞。

[1]陸燕,魏銳利,蔡季平,等.甲狀腺相關(guān)性眼病眼外肌來(lái)源成纖維細(xì)胞的原代培養(yǎng)和鑒定[J].眼科新進(jìn)展,2011,31(5):91-92.

[2]肖莉,蘇敏,石清明.兔角膜緣干細(xì)胞體外培 養(yǎng)方 法的研 究[J].西 南國(guó)防醫(yī)藥,2010,20(3):121-122.

[3]趙杰,蔡可麗.雷帕霉素對(duì)培養(yǎng)的人Tenon's囊成纖維細(xì)胞的作用[J].山東大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版),2007,45(6):55-56.

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：1671-8194（2013）09-0087-02

深圳市科技計(jì)劃項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)201002132）；廣東省自然科學(xué)基金項(xiàng)目（項(xiàng)目編號(hào)S2012040006423）