聶佳佳，金 鑫，孟憲臣，朱國強

（揚州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院，揚州 225009）

長期以來，RNA一直被人們誤解，認(rèn)為僅是DNA和蛋白質(zhì)之間的“中介”，是遺傳信息的“過渡”，它從DNA獲得遺傳信息再把它轉(zhuǎn)譯成蛋白質(zhì)，從而確保了遺傳信息的穩(wěn)定。直到1967年，通過對大腸桿菌體內(nèi)所有的RNA進(jìn)行標(biāo)記，在聚丙烯酰胺凝膠上探測到一種數(shù)量較多的新RNA分子，并將其命名為sRNA-6S RNA[1]，人們才窺探到sRNA世界的冰山一角。近年來，隨著生物信息學(xué)、cDNA文庫及分子克隆等技術(shù)的發(fā)展，在原核生物體內(nèi)越來越多的小分子RNA被發(fā)現(xiàn)，我們才真正領(lǐng)略到了小分子RNA的無限魅力。

細(xì)菌非編碼小 RNA (Non-coding，small RNA，簡稱sRNA）是一類長度為40～500個核苷酸，在基因組中被轉(zhuǎn)錄但是不編碼蛋白質(zhì)的一類RNA分子[2]，轉(zhuǎn)錄通常開始于一段能折疊成穩(wěn)定莖環(huán)結(jié)構(gòu)的序列，終止于一個Rho不依賴的轉(zhuǎn)錄終止子，莖環(huán)結(jié)構(gòu)有助于穩(wěn)定整個分子, 因此大多數(shù)sRNA明顯比mRNA穩(wěn)定。sRNA在感應(yīng)外界環(huán)境變化，控制基因表達(dá)中發(fā)揮十分重要的作用。大多數(shù)sRNA位于2個蛋白編碼基因之間的非編碼區(qū)，即閱讀框（open reading frame，ORF）之間。還有一些 sRNA 是從mRNA的5'或3'非轉(zhuǎn)譯區(qū)域剪切下來的。sRNA廣泛存在于各種細(xì)菌染色體上，少部分存在于質(zhì)粒、噬菌體或轉(zhuǎn)座子上[3]。

1 sRNA的作用機制以及分類

現(xiàn)已證明幾乎所有的生物體均含有sRNA分子。但細(xì)菌中sRNA分子的生物學(xué)功能大多尚未闡明。就目前已鑒定的sRNA，根據(jù)其生物學(xué)功能以及作用機制可分為3大類:

1.1 具有特殊活性的sRNA行使持家功能的sRNAs，它們高度表達(dá)并且是必需的。目前發(fā)現(xiàn)此類細(xì)菌sRNA有三種，包括具有酶催化活性并形成RNase P的催化亞單位M1RNA、轉(zhuǎn)移信使RNA（transfer messenger RNA，tmRNA 或 10SaRNA）[4]以及組成核糖核蛋白（ribonueleoprotein，RNP）復(fù)合物 4.5S RNA。

1.1.1 M1 RNA M1 RNA 是一種具有特殊功能的sRNA，是RNase P（一種關(guān)鍵的RNA加工酶，對細(xì)胞存活是必需的)的催化亞單位，長377個核苷酸，由初始轉(zhuǎn)錄物經(jīng)RNase E在3'端加工而成。RNase P具有內(nèi)切酶活性，能夠?qū)RNA前體的5'端進(jìn)行剪切形成成熟的tRNA。

1.1.2 tmRNA tmRNA 同時具有 tRNA 和 mRNA 的性質(zhì)，又稱10saRNA，長363 nt，是迄今為止發(fā)現(xiàn)的唯一、且在所有細(xì)菌中均存在的sRNA。它在體外可以被丙氨酰tRNA合成酶氨酰化，說明tmRNA具有類似tRNA結(jié)構(gòu)。但tmRNA沒有反密碼子的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，比tRNA大得多。同時，tmRNA分子含有一個開放閱讀框，可以編碼長度為8～35個氨基酸殘基的羧基端標(biāo)記序列，說明它還具有mRNA的特性。正因為如此，在反式轉(zhuǎn)譯反應(yīng)中，tmRNA分子在小分子蛋白SmpB的參與下，起到tRNA和mRNA的雙重功能作用，丙氨酰-tmRNA識別由于mRNA 缺乏終止密碼子而停滯在mRNA 3'端停滯的核糖體，并進(jìn)入A位；新生肽轉(zhuǎn)移至tmRNA的丙氨?；希颂求w則轉(zhuǎn)位至tmRNA編碼的標(biāo)記序列的閱讀框結(jié)構(gòu)上，生成由缺少終止密碼子的mRNA編碼的多肽，該多肽羧基末端加上了標(biāo)記序列。而帶有該標(biāo)記序列的多肽則成為了蛋白質(zhì)水解酶的目標(biāo)。停滯的核糖體在標(biāo)記序列ORF的終止密碼處脫落，能夠進(jìn)入到新蛋白質(zhì)合成中去，從而減少由于停滯的核糖體和不完整的蛋白質(zhì)對細(xì)胞產(chǎn)生的損傷[5]。

1.1.3 4.5S RNA 4.5S RNA 在蛋白質(zhì)分泌過程中作為信號識別顆粒（SRP）的一個必需組分起作用。長114 nt，由前體分子經(jīng) RNase P 5'端加工而來。在細(xì)胞中，編碼4.5S RNA的基因是必需的，常與核糖體相結(jié)合而在轉(zhuǎn)譯過程中起作用，與SRP及其受體（FtsY蛋白）一起介導(dǎo)蛋白質(zhì)靶向內(nèi)質(zhì)網(wǎng)或細(xì)菌質(zhì)膜的運輸。缺乏該基因會抑制蛋白質(zhì)合成[6]。

1.2 與蛋白質(zhì)相互作用而影響蛋白質(zhì)功能的sRNA這類sRNA主要通過與蛋白質(zhì)相互作用從而影響這些蛋白質(zhì)的生物學(xué)功能，本文著重介紹以下兩個sRNA:6S RNA是除了rRNA和tRNA外大腸桿菌中已測定序列的第一個RNA分子[7]，為一個雙順反子mRNA的一部分轉(zhuǎn)錄而來的。長度為184 nt，在原核生物中高度保守并且在穩(wěn)定期逐漸積聚, 它能夠與σ70- RNA聚合酶相互作用并改變它對啟動子識別的特異性[8]。PspF 基因是高pH條件下細(xì)菌生存所必需的，序列分析顯示其-10 bp上游含有TGn序列，是6S RNA作用的靶 mRNA[9-11]。6S RNA能夠與s70-RNA聚合酶全酶結(jié)合改變RNA聚合酶的活性，從而抑制啟動子區(qū)域-10 bp上游含TGn序列（TGnTATAAT）基因的轉(zhuǎn)錄。6S RNA可能的作用是穩(wěn)態(tài)期均衡營養(yǎng)的需求，降低應(yīng)激條件的應(yīng)答以儲存能量[7,12]。

CsrB RNA和CsrC RNA能夠與全局轉(zhuǎn)錄后調(diào)控因子CsrA蛋白相互作用形成一個調(diào)控反應(yīng)回路。在這個回路中，這2個RNA分子作為CsrA蛋白的拮抗物，嚴(yán)緊地調(diào)控著該蛋白的活性。CsrA是由61個氨基酸殘基組成的小分子轉(zhuǎn)譯調(diào)控蛋白，通過與glgC (糖原代謝)基因轉(zhuǎn)錄物的核糖體結(jié)合位點周圍的序列結(jié)合抑制轉(zhuǎn)譯的起始。大腸桿菌中sRNA分子CsrB全長369 nt，有22個與CsrA結(jié)合位點一致的序列，可通過與CsrA結(jié)合抑制CsrA的功能。CsrC也通過相同的方式作為CsrA蛋白的拮抗物發(fā)揮調(diào)節(jié)功能[13]。

1.3 與目的mRNA配對結(jié)合調(diào)控基因表達(dá)的sRNA這是細(xì)菌sRNA發(fā)揮調(diào)節(jié)功能最為普遍的一種形式，目前發(fā)現(xiàn)的細(xì)菌sRNA中絕大多數(shù)都屬于這個類型。sRNAs同靶位mRNA結(jié)合后，要么抑制或促進(jìn)靶標(biāo)mRNA的轉(zhuǎn)譯，要么加速或減緩靶標(biāo)mRNA的降解，而且它們大部分都依賴于和RNA伴侶Hfq的結(jié)合發(fā)揮作用。

1.3.1 sRNAs與目標(biāo)mRNA通過不完全的堿基配對結(jié)合后，影響RNA酶對靶mRNA的作用，對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié) 例如，sRNA分子RyhB對靶基因sodB、sdhC、fumA等的調(diào)節(jié)。RyhB全長90 nt，主要作為轉(zhuǎn)錄后抑制子影響mRNA的穩(wěn)定性，從而對鐵的代謝進(jìn)行調(diào)節(jié)。RyhB的表達(dá)受Fur蛋白抑制。研究發(fā)現(xiàn)Fur蛋白通過負(fù)調(diào)控RyhB來間接調(diào)控細(xì)菌內(nèi)儲鐵蛋白基因(bfr)和細(xì)胞內(nèi)那些含鐵的非必需元件基因(sodB、sdhC、fumA)的表達(dá)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)鐵缺乏時，F(xiàn)ur蛋白失活，RyhB表達(dá)水平升高,與sodB、sdhC、fumA和bfr等基因的mRNA配對后，通過與RNase E形成降解復(fù)合體對這些基因的mRNA進(jìn)行降解[18]，從而減少鐵的儲存和消耗[14]。

同時，sRNA除了通過堿基配對促進(jìn)靶標(biāo)mRNA降解之外，有些細(xì)菌sRNA可以結(jié)合在靶標(biāo)mRNA的3'端，起到穩(wěn)定靶標(biāo)mRNA的作用。

1.3.2 sRNA調(diào)節(jié)子與靶mRNA互補配對后，也可通過影響靶mRNA與核糖體結(jié)合，對目的基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)節(jié) 例如，Spot42和OxyS能夠封閉靶mRNA的核糖體結(jié)合位點抑制靶基因的表達(dá)，DsrA和RprA與靶RNA配對結(jié)合后則可暴露其核糖體結(jié)合位點促進(jìn)目的基因轉(zhuǎn)譯。

sRNA Spot42 全長 109 nt，能夠?qū)?gal操縱子進(jìn)行調(diào)節(jié)，從而使UDP-半乳糖差向異構(gòu)酶（由galE基因編碼）和半乳糖激酶（由galK基因編碼）的比例發(fā)生改變，以適應(yīng)不同的生存環(huán)境。這個sRNA可與galE mRNA的一些序列配對，而這些序列與galK基因的核糖體結(jié)合位點相互重疊，從而阻斷galk的轉(zhuǎn)譯，而galE的表達(dá)未受影響, 因此使得galK編碼的半乳糖激酶和由galE編碼的UDP-半乳糖-4-差向異構(gòu)酶水平發(fā)生改變以應(yīng)對不同的生存狀態(tài)[15]。

OxyS對轉(zhuǎn)錄激活因子fhlA的調(diào)節(jié)也是通過與fhlA的mRNA配對結(jié)合，封閉核糖體結(jié)合位點，阻止核糖體與fhlA的結(jié)合，阻止核糖體與fhlA的結(jié)合，抑制fhlA的轉(zhuǎn)譯而實現(xiàn)[16]。

sRNA與靶mRNA結(jié)合后也能釋放核糖體結(jié)合位點從而激活基因的表達(dá)。正常細(xì)胞狀態(tài)下，rpoS基因5'端非轉(zhuǎn)譯區(qū)以折疊的形式存在，掩蓋了核糖體結(jié)合位點，使其轉(zhuǎn)譯處于關(guān)閉狀態(tài)。饑餓、滲透壓等條件下，DsrA和RprA與rpoS的mRNA 5'端UTR配對結(jié)合，釋放SD序列，暴露核糖體結(jié)合位點，促進(jìn)rpoS蛋白的轉(zhuǎn)譯，增加大腸桿菌對不利環(huán)境的適應(yīng)性[17]。

1.3.3 RNA 分子伴侶蛋白 Hfq sRNA 與靶 mRNA 的配對大多需要Hfq的參與。Hfq分子量為11.2 kDa，最初是作為大腸桿菌RNA噬菌體Q復(fù)制所需要的宿主因子而被發(fā)現(xiàn)[18]。進(jìn)一步研究表明Hfq與真核細(xì)胞和古細(xì)菌細(xì)胞體內(nèi)的剪切體，mRNA降解復(fù)合體中的核心蛋白Sm和Sm樣蛋白同源[19]。

Hfq由一個a螺旋和5個β折疊形成同源六聚體，能夠與單鏈RNA中富含A、U的序列結(jié)合，增加sRNA的穩(wěn)定性。Hfq參與sRNA轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的機制還不清楚。目前有兩種推測。第一種是Hfq與sRNA結(jié)合后，改變sRNA的結(jié)構(gòu)，暴露出與靶mRNA配對的序列，與靶mRNA形成sRNA-mRNA 穩(wěn)定結(jié)構(gòu)，Hfq本身的結(jié)構(gòu)并不改變。另一種則是Hfq同時使sRNA和mRNA的局部濃度升高，利于sRNA-mRNA復(fù)合物的形成[20]。

2 sRNA作用

sRNA對細(xì)菌的生長、繁殖具有重要的調(diào)節(jié)作用，它們的主要功能是感應(yīng)環(huán)境的變化，調(diào)控細(xì)胞的代謝途經(jīng)、生長方式使之與環(huán)境相適應(yīng)，以及控制細(xì)菌毒力基因的表達(dá)。因此，sRNA與細(xì)菌適應(yīng)外界環(huán)境、營養(yǎng)代謝以及毒力基因表達(dá)有著密切關(guān)系。以下將對sRNA在調(diào)控細(xì)菌的鐵代謝、群體感應(yīng)及生物膜形成、適應(yīng)環(huán)境變化以及調(diào)控毒力基因的表達(dá)等過程中的相關(guān)功能進(jìn)一步詳述。

2.1 細(xì)菌sRNA與鐵離子sRNA能迅速關(guān)閉許多蛋白質(zhì)的合成, 改變細(xì)胞必需營養(yǎng)物。其中，鐵離子就是典型的例子。鐵是細(xì)菌生命活動必需的營養(yǎng)元素之一，但濃度過高會對細(xì)菌產(chǎn)生毒害作用，因此，大多數(shù)細(xì)菌利用鐵吸收調(diào)節(jié)蛋白（Fur）調(diào)控鐵的吸收、轉(zhuǎn)運和利用。最近研究表明，細(xì)菌中某些sRNA可調(diào)節(jié)鐵代謝過程中多個基因的表達(dá)，其中研究最深入的是大腸桿菌中受Fur調(diào)控的sRNA RyhB，RyhB是細(xì)菌感受到環(huán)境中鐵離子濃度下降時表達(dá)的一種sRNA，它可以下調(diào)多種靶標(biāo)。當(dāng)環(huán)境中鐵濃度過高時，F(xiàn)ur蛋白與鐵結(jié)合，處于這種構(gòu)象的Fur蛋白能夠結(jié)合RyhB基因，并阻止其轉(zhuǎn)錄，從而使細(xì)菌鐵儲存蛋白和非必需的鐵硫蛋白基因（如超氧化物歧化酶基因sodB，sdhCDAB操縱子等）大量表達(dá)，鐵離子被迅速利用，細(xì)胞內(nèi)鐵濃度維持正常水平[21,22]。當(dāng)環(huán)境鐵濃度較低時，F(xiàn)ur蛋白失去鐵原子發(fā)生構(gòu)象改變，不再能夠與RyhB基因結(jié)合，失去了對RyhB基因轉(zhuǎn)錄的阻遏作用，于是RyhB得以表達(dá)。RyhB通過與鐵儲存蛋白和非必需的鐵硫蛋白mRNA部分序列的堿基配對，降低其mRNA穩(wěn)定性和轉(zhuǎn)譯效率，使其表達(dá)受抑制，從而減少鐵的儲存和消耗[23]，讓更多的鐵能夠被節(jié)省下來用于細(xì)菌最基本的生理需求。

2.2 調(diào)控細(xì)菌群體感應(yīng)和生物膜形成在細(xì)菌生長過程中，能夠釋放特定信號分子，使細(xì)菌可以感知周邊環(huán)境中的同類數(shù)量，以此來調(diào)節(jié)自身多種基因的表達(dá)，這種現(xiàn)象稱為群體感應(yīng)（quorum sensing，QS），而這類信號分子稱為自體誘導(dǎo)子（autoinducer，AI）。這是一種對細(xì)菌群體的基因表達(dá)調(diào)控, 也是一種細(xì)菌細(xì)胞間的通訊方式。AI擁有可以自由進(jìn)出細(xì)胞膜的性質(zhì)，因此，隨著細(xì)菌在一個封閉環(huán)境中的細(xì)胞數(shù)目不斷增加，細(xì)胞外的信號分子，即AI分子的濃度也不斷提高；當(dāng)AI濃度達(dá)到一定閾值時，某些特異性基因的表達(dá)被啟動，在許多QS系統(tǒng)中，這種基因的啟動是由多種sRNA決定的[24]。

2.3 細(xì)菌sRNA感知環(huán)境因素變化并調(diào)控毒力基因的表達(dá)細(xì)菌sRNA的功能與細(xì)菌適應(yīng)環(huán)境變化有著直接的關(guān)系[12]，其功能主要是感受生存條件的改變而調(diào)整細(xì)菌的基因表達(dá)， 使之適應(yīng)環(huán)境的變化；當(dāng)然細(xì)菌毒力和細(xì)菌生活環(huán)境是相關(guān)的，因此，sRNA對細(xì)菌的毒力也有巨大的影響[25]。當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入宿主體內(nèi)，細(xì)菌感受到環(huán)境的改變，從而調(diào)整自身毒力基因的表達(dá)，最有效地促進(jìn)細(xì)菌的生長、繁殖和擴散。多數(shù)情況下，細(xì)菌進(jìn)入機體后，環(huán)境非常適合于細(xì)菌的生長，因此細(xì)菌會大量表達(dá)毒力基因，這些毒力基因產(chǎn)生的蛋白破壞宿主的正常生理狀態(tài)，從而使環(huán)境更加有利于細(xì)菌的生存。一個細(xì)菌sRNA通過調(diào)節(jié)一組相關(guān)基因的表達(dá)，啟動細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)部的相關(guān)機制，導(dǎo)致細(xì)菌對環(huán)境的變化做出最恰當(dāng)?shù)姆磻?yīng)。

細(xì)菌sRNA的轉(zhuǎn)錄受到嚴(yán)格的調(diào)控，這些調(diào)控因子大多是環(huán)境因素。每種環(huán)境因素至少和某一種sRNA相關(guān)，該sRNA可以將環(huán)境改變信號傳導(dǎo)到細(xì)菌胞內(nèi)有關(guān)基因，并引起一系列的反應(yīng)。例如低溫、營養(yǎng)缺乏或者應(yīng)激等惡劣條件均可導(dǎo)致不同的sRNA（如DsrA、RprA等）表達(dá)[26]，這些sRNA都能激活RpoS基因，RpoS蛋白是細(xì)菌RNA聚合酶的一個特別的亞基（σ因子），具有識別特定啟動子的能力，RpoS基因的激活可以啟動一系列下游基因的表達(dá)，使細(xì)菌生長適應(yīng)惡劣的環(huán)境，進(jìn)入穩(wěn)定生長期（降低繁殖速度）。

總而言之，細(xì)菌sRNA在感知環(huán)境變化，進(jìn)而調(diào)控相關(guān)基因表達(dá)，適應(yīng)并改造環(huán)境的過程中起著至關(guān)重要的作用。

3 展望

sRNA作為原核生物中新發(fā)現(xiàn)的一類基因表達(dá)調(diào)控因子，通過感應(yīng)外界環(huán)境條件，在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因的表達(dá)，目前已成為國際上新的研究熱點。雖然已分離的sRNA種類較多并不斷被人們認(rèn)知，但大多數(shù)sRNA功能未知，其作用機制及其調(diào)控網(wǎng)絡(luò)研究仍然處于初級階段。從目前積累的知識分析，原核生物可能借助于這些sRNA對它們的生理系統(tǒng)進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，以便適應(yīng)迅速變化的環(huán)境。因此，深入認(rèn)識這些sRNA可能開辟一個新的研究領(lǐng)域。

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