高冬梅

（山東中醫(yī)藥大學中藥學博士后流動站，濟南250355）

當新世紀曙光升起的時候，人類基因組測序工作已接近尾聲，進一步了解基因產(chǎn)物及其相互關系及實現(xiàn)從基因結構到基因功能跨越的后基因組研究，已成為生命學科的熱切要求。應運而生的基因芯片技術給后基因組研究提供了有力的技術支持。與此同時，中醫(yī)界的一些有識之士也紛紛撰文憧憬著基因芯片技術在中醫(yī)藥研究的應用［1］。中藥品種繁多，如何篩選出有效中藥，進而從有效中藥中篩選出有效成分，并快速進行中藥毒理學研究，如何高效、快捷地應用于臨床，是中藥藥理研究的重大問題。傳統(tǒng)的方法學對逐個單味藥進行分析，進而對其不同有效成分（單體）進行實驗，其過程復雜，耗時多，投入量大，但產(chǎn)出卻很少。相反，如果采取高通量基因芯片篩選方法，快速篩選出有效成分，并快速完成毒理學實驗，并利用計算機系統(tǒng)綜合分析各種成分間相互作用關系，繪制出中藥復雜成分間相互作用的可能圖譜，有望大大加快中藥現(xiàn)代化進程，也為中藥產(chǎn)業(yè)化提供技術保障。

基因芯片又稱DNA微陣列技術，簡稱DNA芯片。最早是由E.Southern在1989年提出，是在芯片上按照特定的排列方式，固定上大量探針，形成一種DNA微矩陣，將樣品DNA／RNA擴增、體外轉錄等技術摻入標記分子后，與位于芯片的探針雜交通過同位素法、化學熒光法、化學發(fā)光法或酶標法顯示，利用計算機進行綜合分析，獲得樣品中大量基因序列及表達的信息。該技術具有高通量和平行檢測的優(yōu)勢?，F(xiàn)就近10年基因芯片在中藥領域的應用與意義闡述如下。

1 基因芯片在中藥領域的應用

1.1 在基因水平上尋找藥物靶標，解釋藥物作用機制將中藥視為組合化學庫，篩選其中的有效成分，由此比較基因芯片上基因表達譜的變化，則有可能開發(fā)作用機制較明確的新中藥。采用所謂 “譯碼器”策略 （decoder strategy）來確定藥物靶標，從而找到 “導向藥物”或“特效藥”。當然，從中藥及其復方中篩選離子通道特異性調(diào)節(jié)劑、蛋白激酶抑制物或激活劑、細菌或腫瘤組織的耐藥性抑制劑等，都可采用基因或蛋白質(zhì)芯片技術，將中藥及其復方直接作用于基因組或蛋白組，觀察特定基因表達或蛋白質(zhì)構象或活性。傳統(tǒng)的膜片鉗或受體藥理方法發(fā)現(xiàn)，川芎嗪、粉防己甲素具有鈣通道拮抗劑作用，這種研究是復雜的。如果采用基因芯片，從人類基因庫中提取所有離子通道基因，采用芯片技術，在不同基因及其表達的蛋白上加上中藥，觀察中藥對基因表達或蛋白構象變化的影響，從而迅速了解此藥物的可能作用機制［2］。托婭等［3］利用基因芯片技術，從基因水平解釋抗腫瘤血管生成中草藥的有效組分T3d的分子機制，采用人胃癌BGC823細胞和血管內(nèi)皮細胞 （EC），結果BGC823細胞組有2.53%基因表達譜發(fā)生明顯的變化，其中158條基因在經(jīng)過T3刺激后表達量明顯上升，44條明顯下降。EC組有0.456%的基因表達譜發(fā)生明顯的變化，其中30條基因在經(jīng)過T3刺激后表達量明顯上升，7條明顯下降。因此利用基因芯片技術可以從基因水平解釋中藥的作用機制［4－8］，為新藥的開發(fā)提供依據(jù)。

在新藥開發(fā)中，高通量的DNA芯片可發(fā)現(xiàn)眾多的新基因和新的靶分子用于新藥的設計。噬菌體展示技術可創(chuàng)造大量蛋白質(zhì)，目前多用于抗體庫的建立和篩選，進而可用于受體－配體相互作用的研究?；蚪M學、蛋白質(zhì)組學和生物信息學 （bioinformatics）將大大促進制藥工業(yè)的發(fā)展。目前第一個生物分子工程藥物Herceptin已用于乳癌的治療，并獲得美國FDA的批準。除腫瘤外，用分子生物工程設計的藥物可用于治療遺傳病及代謝疾病，延緩衰老，也可用分子生物工程技術設計新的抗生素和工業(yè)用酶等。同時，一種藥物的作用是多方面的，基因芯片有助于發(fā)現(xiàn)一種藥物的新功能。原先設想的作用是針對某一靶標的，但在全基因或廣范圍篩選中卻發(fā)現(xiàn)該藥在另一方面有很強的抑制作用，從而為開發(fā)成另一種新藥開辟新途徑。

1.2 鑒定藥物的潛在效應 基因芯片在用來研究藥物的作用機制時十分有用。Matron［9］等人利用基因芯片構建了免疫抑制性藥物FK506處理酵母細胞后的基因表達圖譜。發(fā)現(xiàn)用FK506處理的酵母細胞基因表達圖譜與FK506靶標的無意義突變體相似；而用FK506去處理此突變體，發(fā)現(xiàn)了不同于野生型的作用機制。Clarke等［10］應用基因芯片研究了腸癌患者化療前和治療期間腫瘤基因表達情況，發(fā)現(xiàn)絲裂霉素C和5－氟尿嘧啶治療均可使糖苷合成酶和尿嘧啶－DNA糖基酶的基因表達增加。該研究提示，這類研究既有助于闡明藥物的作用機制，也有助于確定藥物作用的靶基因，為新藥研究提供線索。通過這種方法能有效地篩選出有效中藥及其有效成分。

1.3 用于芯片毒理學研究 應用芯片查找藥物的毒性或不良反應，進行毒理學研究。尤其是慢性毒性和不良反應，普通的藥理學方法耗時長，需要的人力和物力多，而且還有可能遺漏某些可能存在的潛在毒性和不良反應。而在基因水平進行分析，觀察中藥對人體一些看家基因（house－keeping gene）成分是否具有影響，如細胞骨架基因、組蛋白基因等，便能徹底了解該中藥的可能毒性和不良反應。如果該藥能抑制重要基因的表達，則對它的深入研究就值得考慮。如果中藥中某種成分具有這種作用，那么對它進行改造時，就應該去除該成分，以便取長補短。目前國內(nèi)尚未正式進行基因芯片的藥理學研究，但中藥藥理學研究可以借鑒西藥藥理研究方法，從而給中藥藥理研究帶來啟示。

在國外，利用芯片進行藥理學實驗已相當普及。Nuwaysir等［11］研制了包括涉及細胞凋亡、DNA復制和修復、氧化應激或氧化還原內(nèi)穩(wěn)態(tài)、過氧化物酶體增殖反應、二惡英或多環(huán)芳烴反應、雌激素反應、看家基因、癌基因和抑癌基因、細胞周期控制、轉錄因子、激酶、磷酸酶、熱休克蛋白、受體、細胞色素P450等共2090個基因的毒理芯片 （Tox Chip v1.0），該芯片既可用于毒物的檢測和遺傳多態(tài)性的檢測，又可用于受檢毒物的毒性作用機制研究。2000年，牛津大學的Pennie等［12］構建了ToxBlot芯片，并對基因芯片技術應用于毒性機制和毒性預測進行了研究。ToxBlot芯片能夠完成有關內(nèi)分泌的破壞、肝細胞毒性和胰島素敏感化合物骨髓毒性的研究。最近，Holden等從人和小鼠文庫中選擇約600個與毒理學相關基因的cDNA克隆，制備了種屬特異的病理基因組學芯片，可研究肝臟毒性、內(nèi)分泌干擾、致癌作用等毒性終點的作用機制，也可用于確定以基因表達模式為基礎的化合物的毒性。此技術應用于毒理研究目前國內(nèi)尚未見報道，但可以預見，如中藥藥理學研究引入基因芯片技術，將大大推動中藥研究的國際化進程，對闡明中藥作用機制，具有無可估量的重要意義。

1.4 有效中藥和中藥有效成分的大規(guī)模篩選 中藥的有效成分十分復雜，傳統(tǒng)的藥理研究方法周期長，耗時多，所需財力大，而采用基因芯片研究，將數(shù)千種不同中藥或中藥不同成分作用于一定的培養(yǎng)細胞后，甚至是人體的克隆細胞，觀察它們對基因表達的影響，從而能從基因組水平了解它們的作用機制與作用范圍，大大加快有效中藥和中藥有效成分的大規(guī)模篩選過程。另外，對新發(fā)現(xiàn)的中草藥的功能鑒定也起到一定的作用。目前，這種用于藥材鑒別的基因芯片仍處在研究階段，已有人對貝母進行特異性序列和鑒別芯片的實驗研究，相信不久的將來基因芯片就會廣泛應用于中醫(yī)藥領域［13］。

1.5 中藥復方研究 中藥復方成分復雜，傳統(tǒng)方法是將其中的中藥進行不同組合，進行 “拆方”、“組方”，從而推出復方的可能作用機理，而且其作用僅限于研究的某一方面或幾方面作用，很難對該復方有全面的認識，尤其是對新功能的認識和開發(fā)。而采用基因芯片技術，能迅速了解該復方對基因組中某些基因表達的影響，從而不僅了解該復方的原有功能，還有可能很輕易地發(fā)現(xiàn)該復方組方后可能出現(xiàn)的新功能，為復方的新功能開發(fā)提供了客觀依據(jù)［2］。

2 存在問題及展望

2.1 存在問題：①由于人類基因組測序尚未完成，許多基因還不明朗，因此，基因芯片由于所含基因數(shù)不全，以致大量的可能有變化的基因漏網(wǎng)，而明顯影響到研究結果。正由于如此，在目的類似的DDPCR實驗中可以發(fā)現(xiàn)許多新的基因片段。②以動物模型為工具進行各項研究，由于此動物 （小鼠、大鼠等）的基因測序工作還沒有大面積展開，需要更晚些時候才能完成。③由于哺乳類動物基因組數(shù)量大，測同一細胞組織，就目前的基因芯片規(guī)模，整個基因組需要許多塊芯片，研究工作量和研究成本會很高而且研究費用高昂。④實驗數(shù)據(jù)龐大，且大量的基因功能還不明朗，因此給進一步研究帶來困難。⑤基因芯片技術本身存在假陽性率偏高，較嚴重影響臨床應用價值；其次是首先要對標本進行PCR擴增，增加操作復雜性［14］。

2.2 發(fā)展前景 雖然有問題存在，但基因芯片技術為生命科學展現(xiàn)出絢麗的前景：①隨著人類、大鼠、小鼠，甚至兔、狗、猴等基因組測序完成，將有可能生產(chǎn)出全套基因組芯片，使基因芯片在生命科學、醫(yī)學等相關領域應用。②當基因芯片生產(chǎn)技術趨于成熟，可能會大批量生產(chǎn)，將有可能降低生產(chǎn)成本，降低售價，易于普及。③一旦類似高效的蛋白芯片技術的解決，與基因芯片的配套使用，將會對生命科學研究取得質(zhì)的突破。④多學科交叉，各項技術向縱深。例如計算機技術的發(fā)展，讀片分析自動化程度增加，將使基因芯片技術更加完善、實用。⑤不同基因功能研究的積累，以及基因功能研究技術的發(fā)展與普及，使基因芯片研究的后續(xù)工作得以有效地開展，基因芯片的科學價值即實用價值將得到充分的體現(xiàn)和迅速發(fā)展［1］。

［1］方肇勤.基因芯片技術及其在中醫(yī)基礎實驗研究中的應用［J］.上海中醫(yī)藥大學學報，2001，1（15）：17－19.

［2］張發(fā)寶，李欣梅.基因芯片技術在中醫(yī)藥研究中的應用［J］.安徽中醫(yī)學院學報，2002，3（21）：57－59.

［3］托婭，蘇秀蘭.基因芯片在抗腫瘤血管生成中草藥相關基因篩選中的研究［J］.第二軍醫(yī)大學學報，2002，23（3）：273－275.

［4］王興，任敏.糖腎平膠囊對糖尿病小鼠大血管基因表達的影響［J］.中國天然藥物，2005，1（3）：53－55.

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［10］Clarke PA，George M，Cunningham D.Analysis of tumor gene expression following chemotherapeutics of patients with bowel cancer［J／OL］［J］.Nat Am Inc.1999.

［11］Nuwaysir EF，Bittner M，Trent J.Microarrays and toxicology：The advent of toxicogenomics［J］.Mol Carcinog，1999，24（3）：153－159.

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