付蘊敏

（上海新亞藥業(yè)有限公司新先鋒制藥廠，上海201203）

0 引言

兩性霉素B為多烯類抗真菌抗生素，臨床上用于治療深部真菌引起的內(nèi)臟或全身感染，該藥物已有50余年的歷史。近年來，隨著廣譜抗菌素和皮質(zhì)激素的廣泛應(yīng)用，腫瘤和化療病人的增多，介入治療和深靜脈置管技術(shù)的開展，真菌深部感染的發(fā)生率大幅度上升。兩性霉素B因其抗菌譜廣、療效確切，在臨床上有不可替代的價值。

大孔吸附樹脂是一類不含交換基團，且具有大孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子吸附樹脂，具有物理化學穩(wěn)定性高、比表面積大、吸附容量大、選擇性好、吸附速度快、再生處理方便等優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于藥物成分的提取、分離、純化工作中。傳統(tǒng)的兩性霉素B原料藥純化工藝要經(jīng)過多次重復結(jié)晶才能達到質(zhì)量要求，收率低、周期長、成本高。本方法是將此大孔樹脂吸附技術(shù)運用于兩性霉素B純化過程，將2種不同的樹脂按最佳比例混合起來，有選擇性地吸附兩性霉素B溶解液中的雜質(zhì)來純化兩性霉素B，提高兩性霉素B原料的質(zhì)量。

1 材料與儀器設(shè)備

上海華震科技有限公司大孔樹脂型號：D832和D816；兩性霉素B，上海新亞藥業(yè)有限公司；600mm×50mm層析柱，國藥試劑儀器有限公司；高效液相色譜儀，Agilent1100；YZ156恒流泵，保定蘭格恒流泵有限公司；磁力攪拌器，國藥試劑儀器有限公司；恒溫水浴鍋，國藥試劑儀器有限公司；DMF、乙醇、甲醇、丙酮等試劑均為工業(yè)級。

2 方法與結(jié)果

2.1 分析方法（HPLC法兩性霉素B含量測定）

儀器：高效液相色譜儀，Agilent1100。

流動相A：乙腈—甲醇—含0.073%乙二胺四乙酸的0.05 mol/L醋酸銨溶液（用冰醋酸調(diào)節(jié)pH值至5.0）（260:450:320）；流動相B：乙腈—甲醇（260:450）；檢測波長：405 nm；流速：1.0m L/m in；進樣量：20μL。

取供試品溶液10m L，加0.01mol/L鹽酸溶液100μL，置60℃水浴加熱10m in，冷卻后，取1m L，置10m L容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，注入色譜儀，記錄色譜圖，在兩性霉素B峰的相對保留主峰時間約為0.6倍處有一雜質(zhì)峰，理論板數(shù)按兩性霉素B峰計算不低于3 000。

先以流動相A洗脫，待兩性霉素B洗脫后，再按表1進行線性梯度洗脫。精密量取對照溶液注入色譜儀，調(diào)節(jié)檢測靈敏度，使主峰高約為滿量程的25%。

表1 梯度洗脫表

供試品溶液制備：取供試品25 mg，精密稱定，置50m L棕色容量瓶中，緩慢滴加二甲基亞砜（DMSO）并旋搖，使其均勻地分散在DMSO中，再加DMSO使其溶解并稀釋至刻度。精密量取2m L，置50 m L棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。制備1份，進樣1針。

對照溶液制備：精密量取供試品溶液2 m L，置100m L棕色容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。制備1份，進樣2針，RSD≤5.0%。

精密量取供試品溶液和對照溶液，分別注入色譜儀，記錄色譜圖。

計算如下：

表2 第一次混合樹脂過柱條件及結(jié)果

2.2 實驗方法

裝柱：不同比例的2種樹脂，濕法裝柱300 m L至600 mm×50 mm層析柱，柱內(nèi)保留過樹脂層10 cm的pH為3.8～4.2的流動相吸附過程備用。

樣品溶解：將10 g兩性霉素B置于比例為1:2的DMF和甲醇混合溶劑中，調(diào)pH至4.5，以50 r/min攪拌溶解，將溶解好的溶液放入18～20℃的恒溫水浴鍋中，保溫備用。

吸附：將保溫后的兩性霉素B溶液（18～23℃），用恒流泵以15m L/min的速率注入層析柱內(nèi)，10m L/m in的溶液速率過樹脂柱，總過柱時間為65～70m in，柱內(nèi)流動相控制為pH至3.5～5.0。

2.3 實驗過程和結(jié)果

2.3.1 第一次混合比例樹脂過柱

以10 g兩性霉素B為溶解量，總樹脂量300m L，并分別以D832和D816 2種樹脂混合比例為3:7、4:6、5:5、6:4、7:3，在兩性霉素B溶解溫度為18～20℃、柱內(nèi)流動相pH為3.8～4.2條件下，以10m L/m in的過柱速率吸附溶解液中的雜質(zhì)。

2.3.2 第一次混合樹脂過柱條件及結(jié)果

第一次混合樹脂過柱條件及結(jié)果如表2所示，第一次過柱后有關(guān)物質(zhì)曲線圖如圖1所示。從第一次混合比例樹脂結(jié)果數(shù)據(jù)及圖表可以看出，在其他吸附條件相同的條件下，當樹脂混合比例趨向于D832:D816為4:6時，樹脂吸附兩性霉素B雜質(zhì)的效果最優(yōu)，產(chǎn)物最大單雜為1.59%，總雜為6.29%。因此，以D832:D816比例為4:6基礎(chǔ)進行最佳吸附樹脂比例的細化研究。

2.3.3 第二次混合比例樹脂過柱

以10 g兩性霉素B為溶解量，總樹脂量300m L，并分別以D832和D816兩種樹脂混合比例為3.4:6.6、3.6:6.4、3.8:6.2、4.0:6.0、4.2:5.8、4.4:5.6、4.6:5.8，在兩性霉素B溶解溫度為18～20℃，柱內(nèi)流動相pH為3.8～4.2條件下，以10m L/m in的過柱速率吸附溶解液中的雜質(zhì)。

2.3.4 第二次混合樹脂過柱條件及結(jié)果

第二次混合樹脂過柱條件及結(jié)果如表3所示，第二次過柱后有關(guān)物質(zhì)曲線圖如圖2所示。第二次混合比例樹脂過柱結(jié)果表明在D832：D816樹脂比為3.6:6.4的情況下，樹脂對兩性霉素B雜質(zhì)的吸附效果最好，最大單雜為1.45，總雜為5.60，較其他比例的混合樹脂吸附雜質(zhì)效果更加顯著。

表3 第二次混合樹脂過柱條件及結(jié)果

3 結(jié)語

利用不同極性的大孔樹脂對兩性霉素B雜質(zhì)的特異性吸附作用，將不同種類的樹脂按最佳比例混合起來，有選擇性地吸附兩性霉素B溶解液中的雜質(zhì)，此方法顯著地降低了兩性霉素B的有關(guān)物質(zhì)，在很大程度上提高了兩性霉素B原料的質(zhì)量。

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