陳洪昌

組織因子相關(guān)微粒(tissue factor-bearing microparticles，TF-MPs)在許多疾病的血栓形成過程中發(fā)揮著重要功能。目前已知，TF-MPs具有促進凝血與血栓形成等多種生物學(xué)活性，可介導(dǎo)很多疾病的凝血機制紊亂，研究TF-MPs的功能有助于深化對凝血機制障礙的認識，并為凝血功能障礙調(diào)控提供潛在的干預(yù)目標(biāo)[1]。

通過對大鼠血栓模型中組織因子相關(guān)微粒的數(shù)目變化及陽性表達情況的分析，探索組織因子相關(guān)微粒對凝血級聯(lián)反應(yīng)的影響關(guān)系，為血栓患者的早期預(yù)防和治療血栓、預(yù)測預(yù)后提供新的思路?，F(xiàn)在就TF-MPs與大鼠血栓模型的影響分析予以綜述。

1 組織因子相關(guān)微粒(TF-MPs)

1.1 TF-MPs的來源 微粒(microparticles MPs)是細胞膜重塑后從受刺激細胞或凋亡細胞中釋放出的片段。在細胞受到刺激或者是細胞在凋亡時，細胞膜的不對稱性遭到破壞，使細胞膜外層的磷脂酰絲氨酸暴露，這些磷脂酰絲氨酸帶負電荷，進而細胞骨架及蛋白構(gòu)架發(fā)生該變，最終，小囊泡從細胞膜脫落形成MPS[2]。通常MPS指的就是位于0.1～1 μm 的細胞膜碎片暴露出的磷脂酰絲氨酸。在微粒的表面，出現(xiàn)了血栓調(diào)節(jié)蛋白、組織因子途徑物、或蛋白質(zhì)C可能提示著微粒MP指導(dǎo)的抗凝血途徑開始。然而，脂多糖治療會促進組織因子的表達，在組織因子和促凝血酶原激酶的刺激下，位于單核細胞和衍生的微粒MP表面的血栓調(diào)節(jié)蛋白的活性是極強的[3，4]。有大量研究顯示，當(dāng)單核細胞、內(nèi)皮細胞、血小板等受到刺激時，能表達釋放出含有組織因子的微粒，這些微粒有明確的TF相關(guān)促凝血活性。當(dāng)血液中表達循環(huán)TF的微粒水平升高時，血液也表現(xiàn)出高凝狀態(tài)，由此可以推斷，通過檢測大鼠血栓模型中的循環(huán)TF微粒水平，研究其血栓形成的特點，可為血栓患者的早期預(yù)防和治療血栓、預(yù)測預(yù)后提供新的思路。

1.2 TF-MPs的定義 當(dāng)MPs從細胞膜上脫落后，在受到脂多糖刺激后，單核細胞和衍生的微粒MP表面的血栓調(diào)節(jié)蛋白的活性是極強的，這些單核細胞脫落出的高表達TF的MPs[5]。這類高表達 TF 的 MPs，稱為 TF-MPs。

1.3 TF-MP的生物學(xué)效應(yīng) 在血管內(nèi)皮損傷后，會刺激凝血級聯(lián)反應(yīng)的放大效應(yīng)，組織因子在止血和血栓形成中起到加速放大的作用。在血漿中，組織因子以多種形式存在，其中就包括微粒和交替拼接而成的組織因子，而以微粒形式存在的就是組織因子相關(guān)微粒TF-MPs。當(dāng)細胞受到刺激或者是凋亡時，TF-MPs大量釋放入血，推測就是TF-MPs促進了凝血級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)展。

在一些凝血功能障礙相關(guān)疾病中，TF-MPs在血漿中的數(shù)目及表達提高，例如敗血癥、動脈粥樣硬化、鐮刀形細胞貧血和癌癥。一份研究顯示，通過提取心臟外科患者的心包積液中的TF-MPs，將其注入大鼠模型中而促進了大鼠靜脈血栓的形成。在健康大鼠體內(nèi)，造血細胞衍生的TF-MPs可增加大鼠提睪肌微循環(huán)的血栓形成。在腫瘤大鼠模型中，組織因子抗原與腫瘤大小密切相關(guān)，增高的腫瘤衍生的微粒水平與升高的凝血-抗凝血混合物水平密切相關(guān)。這些研究強有力地證實了TF-MPs在許多疾病中促進了血栓的形成。

活化的TF-MPs為凝血級聯(lián)系統(tǒng)中的獨特酶復(fù)合體提供了一個額外的促凝血磷脂表面。他們的催化性是依靠促凝血的負離子氨基磷脂、磷脂酰絲氨酸，在細胞膜重構(gòu)后異位到血漿外的小葉。在實驗研究中發(fā)現(xiàn)，TF存在于正常血管的血液循環(huán)中，因此，有學(xué)者推測TF-MPs調(diào)控著凝血的級聯(lián)反應(yīng)，在未受刺激時，TF-MPs處于休眠狀態(tài)，從而不會產(chǎn)生血栓，而且其濃度很低，不會對抗組織因子途徑抑制物;而受到刺激時(如血管受損)，大量的TF-MPs高表達于血循環(huán)中，參與凝血的激活[6]。

2 血栓模型

2.1 血栓模型動物的選擇 血栓動物模型是研究血栓發(fā)病機制及凝血級聯(lián)反應(yīng)的基本實驗條件。在文獻報道中，約有8種動物用來制備血栓模型，而最常見的是用大鼠、兔、犬、豬來制備血栓動物模型。對于研究血栓動物中TF-MPs的變化，采用大鼠作為模型動物最佳，因為大鼠血栓模型最為經(jīng)濟、常用，也適用于對干擾因素對抗血栓機制的研究。兔模血栓模型多用于研究血栓后的靜脈壁組織和細胞的病理學(xué)改變;犬模血栓模型常用于血管介入溶栓及區(qū)栓的相關(guān)研究;豬模血栓模型多用于觀察血管壁的組織學(xué)變化，造價最為昂貴。所以，對于研究TF-MPs在血栓動物模型中的變化及相關(guān)影響因素，最宜選擇大鼠作為造模對象。[7]

2.2 血栓動物模型的制備 目前，建立靜脈血栓動物模型的方法有如下幾種方法:①機械性損傷法。②電流損傷法。③結(jié)扎法。④光化學(xué)法。⑤創(chuàng)傷性肢體深靜脈血栓形成法。⑥化學(xué)藥物致血栓形成法。目前在研究TF-MPs中大鼠血栓模型的制備中，多采用化學(xué)藥物致血栓形成法，也有Falati[8]用光化學(xué)法制備模型，他用激光損傷大鼠的提睪肌動脈制備模型，激光刺激內(nèi)皮細胞產(chǎn)生的TF最少，可避免內(nèi)皮下暴露的TF干擾，但是血栓模型的成功率較化學(xué)藥物法低。

用化學(xué)藥物法制備血栓模型，最常用的是角叉菜膠(Ca)在大鼠皮下注射角叉菜膠后，多數(shù)大鼠尾尖部于3～14 h會出現(xiàn)暗紅色血栓區(qū)，逐漸向尾根部擴大，48～72 h會發(fā)紺變?yōu)楹谏?，而后變干變細，最終脫落。如果對角叉菜膠誘導(dǎo)的大鼠血栓模型成功率不滿意，還可以采用聯(lián)合應(yīng)用角叉菜膠Ca與細菌內(nèi)毒素(LPS)建造大鼠血栓模型。在大鼠腹腔注射Ca，16 h后再靜脈注射LPS，經(jīng)試驗證明，造模后的大鼠尾部均形成了穩(wěn)定的血栓[9]。通過在建模后觀察尾部血栓不同時間的情況，測定外周血中的化驗指標(biāo)，可以得出血栓與凝血指標(biāo)的相互變化。

在以往的敗血癥動物模型中，組織因子的表達促進了血管內(nèi)的凝血及擴散。在循環(huán)血液當(dāng)中，單核細胞是組織因子的主要來源。事實上，在人類毒血癥患者中，磷酯酰絲氨酸(LPS)刺激單核細胞誘導(dǎo)組織因子mRNA和蛋白質(zhì)表達在人類毒素血癥模型中。另外，我們已經(jīng)知道在造血細胞中降低組織因子的表達與在內(nèi)毒素血癥的大鼠模型中降低凝血-抗凝血物水平密切相關(guān)。因此，用內(nèi)毒素構(gòu)建的大鼠血栓模型，更有益于研究TF-MPs在大鼠血液中變化情況。

3 TF-MPs的檢測

3.1 TF-MPs的檢測方式 血漿的組織因子水平可用多種方式檢測，其中包括酶聯(lián)免疫吸附實驗(ELISA)，流式細胞學(xué)計數(shù)，阻抗實驗和激活實驗。組織因子水平已經(jīng)在健康人體中發(fā)現(xiàn)，這些研究結(jié)果的發(fā)現(xiàn)是由于用了不同的抗組織因子抗體和高水平的研究儀器，酶聯(lián)免疫吸附實驗可以檢測組織因子的水平，能被用于測量因子十(FXa)在血漿中產(chǎn)生。然而，最近的研究發(fā)現(xiàn)這項實驗不能測量血漿中激活的組織因子，因為觀察到FXa的產(chǎn)生不能被活性部位滅活的FV11a所抑制。用一種二者擇一的方法分離血漿中的微粒，并且測量它們的促凝活性。用一種稱作1B10的特異抗體捕獲的微粒收集這種微粒?；蚴怯贸匐x心的方法分離這種微粒。在這些研究中，抑制性抗人類組織因子抗體存在與否的情況下，通過兩步發(fā)色激活分析法測量促凝活性。

3.2 TF-MPs的提取 在大鼠(2～3月大)腹膜腔內(nèi)注射細菌內(nèi)毒素(LPS)(7.5 mg/Kg)和角叉菜膠Ca后制備血栓大鼠模型。在藥物注射6 h后，從靜脈腔內(nèi)抽取全血并注入0.38%的檸檬酸鈉。大鼠血漿以4000轉(zhuǎn)超速離心15 min，兩步法離心分離乏血小板血漿(PFP)，此血漿平均分為50微升后，在-80攝氏度下冷凍。

3.3 TF-MPs的檢測 提取好的乏血小板血漿(PFP)，20℃下離心l5 min獲取微粒碎片，棄去225 μl上清液，加入225 μl緩沖液(NaCl 140 mmol/L，KCl4.5 mmol/L，MgCl21 mmo1/L，CaCl22.5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，pH7.4，0.2 m 濾膜過濾)，再次離心;棄去 225 μl上清液，加 75 μl緩沖液，重懸。將100 μl富含微粒的懸液按每份標(biāo)本5 μl進行檢測，加35 μl緩沖液和5 μl牛血清白蛋白(BSA)稀釋，室溫孵育15 min。然后加入2O0 μl緩沖液再次離心。棄去200 μl上清液，加入200 μl緩沖液和100 μl計數(shù)微球，重懸，再次制成微粒懸液。然后用流式細胞儀進行計數(shù)分析，得到數(shù)據(jù)。根據(jù)側(cè)向光散射(Ssc)和前向光散射(Fsc)散點圖設(shè)定標(biāo)準檢測微球門，應(yīng)用7.2 μm和1.0 μm的微球當(dāng)做內(nèi)參照的檢測微粒，把1.O μm微粒用來設(shè)門，7.2 μm乳膠微球用來定量，以結(jié)合Annexin V和結(jié)合TF的抗體定量來定義表達TF的微粒。

4 TF-MPs與大鼠血栓模型對血栓疾病研究的展望

4.1 組織因子相關(guān)微粒在復(fù)雜的血栓形成中起著作用，并且與多種疾病有關(guān)，其中包括敗血癥和癌癥。大鼠作為一個最普通的動物實驗用于活的機體實驗。從以往的研究中，我們看到組織因子陽性微粒和內(nèi)毒素血癥大鼠模型凝血-抗凝血物間有線性回歸關(guān)系，以前的研究結(jié)果顯示出人類組織因子抗原水平有相同的相關(guān)性。這些研究數(shù)據(jù)強有力的指出在內(nèi)毒素血癥和癌癥大鼠模型中組織因子陽性微粒激活了促凝作用。

4.2 在以往的研究中，選擇素類和TF-MPs的促血栓作用是緊密聯(lián)系的。在內(nèi)皮細胞損傷后，大量TF-MPs和白細胞團進入血栓中，這個過程P選擇蛋白(由血小板或內(nèi)皮細胞表層擠出的一種粘附分子)是必須存在的。血小板選凝素糖蛋白配體1(PSGL-1)和血小板P選擇蛋白的相互作用被證明是在血栓邊緣的TF活性集聚的必要因素。在白細胞性血栓相互作用之前，造血細胞衍生的TF蓄積在形成血栓時與MPS積聚的動力學(xué)相關(guān)聯(lián)。在A型血友病的大鼠模型中，可溶性的P選擇蛋白被證明是促進白細胞衍生的TF-MPs脫落，它很可能來自于單核細胞。MPS的血漿水平隨著年齡的增長而增長，但在PSGL-1老鼠模型中是例外的，這說明了PSGL-1途徑的作用。此外，在設(shè)計大鼠模型中，達到了幾倍高度的血漿P選擇蛋白濃度，從而證明了不尋常的促凝血能力和突出的循環(huán)性白細胞衍生MPS包含的TF。P-選擇蛋白所引發(fā)的其他機制可能有助于增加血栓形成傾向。經(jīng)證明，P-選擇蛋白趨向于轉(zhuǎn)移到來自單核細胞衍生的MPs分類的TF，或者是運輸?shù)揭粋€功能性的血小板實體。P選擇蛋白同樣會促進由單核細胞和TF表達的磷脂酰絲氨酸暴露[10]。

4.3 TF-MPs通過P選擇蛋白交互作用的補充作用，可能通過誘導(dǎo)纖維蛋白形成穩(wěn)定的血栓。因為PSGL-1的相互作用通常能調(diào)停不穩(wěn)定的轉(zhuǎn)換，附加的細胞黏合素能夠促進血栓的穩(wěn)定作用。在缺血淤滯的血管中，TF-MPs在血栓形成過程中起著決定性作用。淤滯會局限吸收來的MPS，在設(shè)計的大鼠模型中表現(xiàn)出高水平的白細胞衍生的MPS，并且將其提呈給缺血部位。P選擇蛋白在內(nèi)皮細胞促成MPS募集增強反應(yīng)中起正調(diào)節(jié)作用，這導(dǎo)致在深靜脈中可看到的大量血栓。靜脈血栓栓塞疾病的患者中，內(nèi)皮細胞，血小板和白細胞明顯的活動性可能證明通過檢測TF-MPs、P選擇蛋白的表達和血小板白細胞的集聚是有意義的[11]。

5 總結(jié)

近年來，越來越多的研究著重于TF-MPs在心血管疾病、腫瘤、炎癥及血栓類等疾病中的臨床應(yīng)用，結(jié)果發(fā)現(xiàn)TF-MPs水平增高及MPs相關(guān)TF活性增高對血栓形成及疾病的進展密切相關(guān)。目前，通過對大鼠血栓模型進行干預(yù)，研究其血漿中的組織因子數(shù)量及活性變化與大鼠血栓情況的關(guān)系，可以為血栓類疾病的發(fā)展及預(yù)后提供參考，可為血栓患者的治療提供新的思路。

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