金明蘭 李杭 王盛 楊曉凱

(1:吉林建筑大學(xué)松遼流域水環(huán)境教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，長(zhǎng)春130118;2:通化市物業(yè)管理辦公室，通化134001;3:通化市醫(yī)藥高新技術(shù)產(chǎn)業(yè)開(kāi)發(fā)區(qū)特達(dá)房屋拆遷有限公司，通化134001;4:通化市東昌區(qū)物業(yè)管理中心，通化134001)

近年來(lái)，隨著分子生物學(xué)技術(shù)和信息技術(shù)的迅猛發(fā)展，人們能夠借助計(jì)算機(jī)的輔助設(shè)計(jì)、模擬運(yùn)算等功能人工設(shè)計(jì)或改造抗原結(jié)構(gòu)，創(chuàng)造新的免疫原，使基因疫苗開(kāi)發(fā)與應(yīng)用有了更廣闊的前景.但是，轉(zhuǎn)基因生物的環(huán)境安全性與基因工程微生物使用的環(huán)境安全性的問(wèn)題，已成為國(guó)際社會(huì)生物安全管理的焦點(diǎn)［1］.在基因工程疫苗的研制過(guò)程中，經(jīng)過(guò)重組而攜帶外源基因的生物體一旦逃逸到環(huán)境中，經(jīng)過(guò)基因整合后，可能會(huì)引起生態(tài)系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而打破其在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中所形成的平衡體系，威脅自然界中的生物［2］.有些病毒具有導(dǎo)致靶組織損傷的基因，可能使原本無(wú)害的微生物變得極其危險(xiǎn).我國(guó)政府也非常重視生物安全問(wèn)題，經(jīng)過(guò)多年的探索，明顯深化對(duì)生物安全管理的認(rèn)識(shí)，加強(qiáng)生物安全的管理和監(jiān)督，大力開(kāi)展保護(hù)生物安全與生物多樣性，明確了對(duì)轉(zhuǎn)基因微生物的定殖能力、存活能力、毒性和致病性、遺傳變異能力、生物學(xué)特性，以及在環(huán)境中可能存在的范圍、廣泛應(yīng)用后的潛在影響等方面進(jìn)行安全性評(píng)價(jià)［3］.近年來(lái)，由于世界各地禽流感的暴發(fā)頻率越來(lái)越高、流行面積越來(lái)越廣，因而導(dǎo)致全球?qū)ζ涓叨汝P(guān)注.目前，國(guó)內(nèi)外學(xué)者主要集中研究基因疫苗外源基因的表達(dá)產(chǎn)物的免疫反應(yīng)，而此類(lèi)疫苗的生物安全性評(píng)價(jià)開(kāi)展較少［4］.因此，進(jìn)行生物安全性研究是十分必要的.

本實(shí)驗(yàn)選用重組雞痘病毒作為載體，通過(guò)篩選、鑒定獲得了一株重組流感病毒.為了探討所構(gòu)建基因疫苗的生物學(xué)特性和環(huán)境安全性，將其與土壤、水等比混合后，分別置于37℃，4℃，-20℃條件下，檢測(cè)基因疫苗的存活能力;將其接種小鼠，利用PCR和病毒分離培養(yǎng)等方法對(duì)接種動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境中水、墊料進(jìn)行基因的檢測(cè);同時(shí)將基因疫苗與水、土壤等比混合后分別置于37℃，4℃，-20℃，檢測(cè)基因疫苗的環(huán)境安全性.

1 材料與方法

1.1 材料

(1)主要儀器.CIS凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司);高壓電泳儀(北京六一儀器廠(chǎng));冷凍高速離心機(jī)(Hitachi);核酸檢測(cè)儀(Pharmacia Biotech);熒光顯微鏡(Leitz);CO2培養(yǎng)箱(Sanyo);垂直板電泳儀(美國(guó)BIO-RAD公司).

(2)毒株及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物.重組流感病毒由本試驗(yàn)室構(gòu)建，TCID50為1×10-7/0.1 mL.SPF雞胚由中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供.CEF懸液的按常規(guī)方法制備.健康BALB/c小鼠(6 W～8 W)由長(zhǎng)春生物制品研究所提供，自由采食和飲水，常規(guī)飼養(yǎng).

1.2 試驗(yàn)方法

重組流感病毒擴(kuò)增及毒價(jià)的測(cè)定.將挑斑純化、擴(kuò)增后的基因疫苗，以10 MOI(Multiplicity of infection)分別接種于200 mL培養(yǎng)瓶1×106個(gè)/mL CEF細(xì)胞中，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待72 h～96 h細(xì)胞全部病變后收獲病毒液.病毒液先用4 000 rpm離心20 min去除細(xì)胞碎片，然后30 000 rpm離心2 h，最后用少量PBS重懸濃縮的病毒.制備CEF單層，至細(xì)胞長(zhǎng)至80 %融合時(shí)傾去培養(yǎng)液，用Hank’s液洗兩次，將用于基因疫苗以無(wú)血清MEM進(jìn)行103～108稀釋?zhuān)魅?.2 mL接種于24孔板中，37℃5%CO2培養(yǎng)箱中感作1 h～1.5 h后，補(bǔ)加MEM完全培養(yǎng)液至1 mL，繼續(xù)培養(yǎng)96 h～120 h.在倒置顯微鏡下觀(guān)察出現(xiàn)病毒空斑的最大稀釋孔，計(jì)算基因疫苗的毒價(jià)［5］.

1.3 試驗(yàn)分組設(shè)計(jì)

健康BALB/C小鼠20只隨機(jī)分成2組，每組10只，試驗(yàn)組接種0.1 mL 1×106PFU的基因疫苗，對(duì)照組接種0.1 mL生理鹽水.分別在免疫后1W～4W采集飼養(yǎng)環(huán)境中的水、墊料，按照上述方法進(jìn)行檢測(cè).

1.4 基因疫苗在環(huán)境中生存能力檢測(cè)

基因疫苗以等比與水、土壤混合后分別放置37℃，4℃，-20℃條件中，采用病毒分離培養(yǎng)方法，進(jìn)行生存能力檢測(cè).

1.5 PCR檢測(cè)

設(shè)計(jì)合成FPV 4 b引物，P 1:5'-GATAGAGGATCGTACATCCA-3';P 2:5'-GCGCTAGTATCTATCACAGA-3'.以上述抽提的DNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增:94℃預(yù)變性5 min后，94℃1 min→52℃1 min→72℃90 s，15個(gè)循環(huán);94℃1 min→50℃1 min→72℃90 s，20個(gè)循環(huán);最后72℃延伸10 min.每次PCR反應(yīng)均設(shè)陰性對(duì)照和陽(yáng)性對(duì)照.反應(yīng)完畢后取10μL PCR產(chǎn)物1.2 %瓊脂糖凝膠電泳分析結(jié)果.

1.6 基因疫苗耐熱試驗(yàn)

將病毒原液分別置于50℃，55℃和60℃水浴中，分別感作15 min，30 min，45 min，60 min，作連續(xù)的10倍稀釋?zhuān)∶恳幌♂尪鹊牟《疽?.1 mL，每個(gè)稀釋度的病毒液接種8個(gè)培養(yǎng)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)120 h，記錄細(xì)胞病變，計(jì)算毒價(jià)，進(jìn)行對(duì)比分析.

1.7 基因疫苗耐酸、耐堿試驗(yàn)

將1N鹽酸的過(guò)濾液和1N Na0H的過(guò)濾液分別用Hank’s液調(diào)到pH=3和pH=9，取上述液體3份，每份0.9 mL，在無(wú)菌條件下分別加0.1 mL病毒液，并設(shè)正常Hank’s液0.9 mL加病毒液0.1 mL對(duì)照，在37℃作用1h，按照上述方法計(jì)算毒價(jià)，進(jìn)行對(duì)比分析.

1.8 基因疫苗對(duì)乙醚的敏感性試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，將乙醚用直徑為0.22μm的濾膜過(guò)濾，加入病毒液中，使其最終濃度為20 %，設(shè)對(duì)照病毒組不加乙醚，搖勻后置4℃下24 h，其間搖動(dòng)數(shù)次，低速離心15 min，取下層病毒液作連續(xù)的10倍稀釋?zhuān)凑丈鲜龇椒ㄓ?jì)算毒價(jià)，進(jìn)行對(duì)比分析.

1.9 基因疫苗對(duì)氯仿的敏感性試驗(yàn)

在無(wú)菌條件下，用0.22μL的濾膜將氯仿過(guò)濾，在基因疫苗中加入氯仿，使其最終濃度為1∶19，在4℃下振蕩10 min，然后以3 000 r/min離心15 min，取上清液作連續(xù)的10倍稀釋?zhuān)凑丈鲜龇椒ㄓ?jì)算TCID50，進(jìn)行對(duì)比分析.

1.10 基因疫苗對(duì)胰蛋白酶的敏感性試驗(yàn)

用Hank’s液將胰蛋白酶配成1%濃度(PH 7.2)，取0.5 mL與等量基因疫苗混合，37℃作用1 h，隨后加入經(jīng)滅活的犢牛血清4 mL，終止胰蛋白酶的作用.設(shè)對(duì)照組，用Hank’s液代替1 %胰蛋白酶做同前處理，作連續(xù)10倍稀釋?zhuān)凑丈鲜龇椒ㄓ?jì)算TCID50，并進(jìn)行對(duì)比分析.

1.11 敏感性試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)

在一定的作用條件下，試驗(yàn)組比對(duì)照組感染滴度降低2個(gè)滴度以上者，判為病毒對(duì)該作用條件敏感，降低2個(gè)滴度以下者，判為病毒對(duì)該作用條件不敏感.

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)環(huán)境的水、墊料中病毒DNA檢測(cè)

分別在1 W～4 W采集小鼠飼養(yǎng)環(huán)境中的水、墊料用BiomaxTM離心超濾器對(duì)浸出液上清進(jìn)行濃縮，采用PCR方法檢測(cè)FPV 4 b基因，結(jié)果均未能檢測(cè)到病毒的基因.結(jié)果見(jiàn)圖1.

圖1 接種動(dòng)物水、墊料中FPV 4 b基因PCR檢測(cè)

2.2 基因疫苗在水、土壤中存活能力檢測(cè)

基因疫苗在水、土壤中37℃條件下存活21 d，4℃存活6月，-20℃存活1年以上.

2.3 基因疫苗耐熱試驗(yàn)

基因疫苗經(jīng)加熱處理后，計(jì)算TCID50結(jié)果，按照敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，表明基因疫苗可滅活.結(jié)果見(jiàn)表1.

表1 基因疫苗經(jīng)不同溫度處理后對(duì)CEF的感染性

2.4 基因疫苗耐酸耐堿性試驗(yàn)

基因疫苗在pH 3～9范圍內(nèi)37℃作用1h后，計(jì)算TCID50.按照敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，表明基因疫苗具有一定的耐受穩(wěn)定性.結(jié)果見(jiàn)表2.

表2 基因疫苗經(jīng)不同PH處理后對(duì)CEF的感染性

2.5 基因疫苗對(duì)乙醚、氯仿、胰蛋白酶敏感性試驗(yàn)

在基因疫苗中加入20 %(體積比)的乙醚，4℃作用24 h，按照敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，表明基因疫苗對(duì)乙醚不敏感;在基因疫苗中加入5 %(體積比)的氯仿，4℃作用10 min，按照敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，表明基因疫苗對(duì)氯仿敏感;基因疫苗經(jīng)1 %的胰蛋白酶與等量的基因疫苗混合，37℃作用1 h，按照敏感性判定標(biāo)準(zhǔn)，說(shuō)明基因疫苗對(duì)胰蛋白酶敏感.試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3.

表3 基因疫苗胰蛋白酶、氯仿、乙醚敏感性試驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)語(yǔ)

由于生物技術(shù)的特殊性，其實(shí)驗(yàn)或生產(chǎn)過(guò)程中使用和誘發(fā)的各類(lèi)基因片段、蛋白、細(xì)菌、病毒、抗生素、催化劑及其他化學(xué)藥劑，一旦進(jìn)入環(huán)境可能對(duì)生物多樣性構(gòu)成潛在風(fēng)險(xiǎn)與威脅;生物實(shí)驗(yàn)室中的細(xì)菌、病毒可能直接引起人的免疫系統(tǒng)失調(diào)，對(duì)人體健康造成巨大威脅［6］.因此，對(duì)于新型疫苗的環(huán)境安全性研究已成為重要檢測(cè)指標(biāo).遺傳工程微生物的安全性評(píng)價(jià)主要內(nèi)容有受體微生物的生物學(xué)特性，對(duì)動(dòng)物、植物和其他微生物及人類(lèi)健康與生態(tài)環(huán)境的影響及潛在程度等受體微生物安全性評(píng)價(jià)［7］.轉(zhuǎn)基因微生物在環(huán)境中的存活、繁殖、擴(kuò)散、遺傳變異能力影響人類(lèi)的健康和環(huán)境生態(tài)系統(tǒng)，其中對(duì)人畜的健康和生態(tài)環(huán)境的影響是安全性評(píng)價(jià)的重點(diǎn)［8-9］.為了減少或消除其對(duì)環(huán)境的潛在危害，有必要采取措施對(duì)這些基因工程微生物進(jìn)行監(jiān)測(cè)和安全控制［10］.熱使肽鏈的化學(xué)鍵斷裂，造成病毒的復(fù)制、轉(zhuǎn)錄、翻譯終止，病毒粒子的完整性喪失，或者使病毒粒子不能與細(xì)胞受體結(jié)合，病毒不能脫殼或病毒成分不能裝配和釋放.本試驗(yàn)中，重組病毒經(jīng)50℃水浴作用60 min，55℃水浴30 min或經(jīng)60℃水浴15 min，病毒全部被滅活，表明該病毒對(duì)熱抵抗力有限.不同的病毒對(duì)pH變化的穩(wěn)定性差異較大，重組病毒分別在pH 3.0，pH 9.0中處理1 h，毒價(jià)較對(duì)照減少不到1個(gè)滴度，說(shuō)明該病毒對(duì)酸堿均有一定的耐受能力;重組流感病毒與胰蛋白酶作用后，胰蛋白酶能破壞病毒粒子的衣殼蛋白，去除病毒表面的受體，使病毒粒子喪失吸附細(xì)胞的能力，因而對(duì)胰蛋白酶敏感;重組流感病毒經(jīng)胰蛋白酶37℃1 h，毒價(jià)降低2個(gè)滴度以上，說(shuō)明病毒對(duì)1 %的胰蛋白酶敏感.病毒粒子主要依靠表面結(jié)構(gòu)進(jìn)行吸附和侵入宿主細(xì)胞，丟失了脂質(zhì)的病毒粒子不再具有吸附和侵入能力.重組流感病毒經(jīng)5 %的氯仿作用10 min后感染滴度大幅度降低.以上結(jié)果表明，重組病毒的生物學(xué)特性未發(fā)生改變條件下PCR、病毒分離培養(yǎng)，證明了重組流感病毒對(duì)飼養(yǎng)環(huán)境無(wú)安全威脅.重組病毒在與土壤、水等比混合后，在37℃條件下存活不超過(guò)21 d，生存能力、復(fù)制、存活能力差，因此不會(huì)污染環(huán)境.基因疫苗免疫動(dòng)物環(huán)境中的水、墊料未檢測(cè)目的基因，證明基因疫苗不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染.

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