張秀英，薛 輝，李 忱，劉佳梅，李 巖，陳 東

（1.吉林大學(xué)護理學(xué)院基礎(chǔ)護理教研室，吉林 長春 130021；2.吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)系，吉林 長春 130021；3.吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院骨科，吉林 長春130033；4.吉林省婦幼保健院眼科，吉林 長春130061；5.廣東醫(yī)學(xué)院組織學(xué)與胚胎學(xué)教研室，廣東 東莞 523808）

目前，“種子細胞＋生物分子＋生物支架”被認(rèn)為是治療脊髓損傷的基本模式[1]。用于移植治療脊髓損傷的種子細胞有多種，其中羊膜上皮細胞（amniotic epithelial cells，AECs）由于具有來源廣泛、免疫原性低、不涉及倫理問題、能分泌各種神經(jīng)營養(yǎng)因子和具有多項分化能力等特點，越來越受到科學(xué)工作者的關(guān)注[2－3]。本課題組應(yīng)用化學(xué)去細胞肌肉支架和AECs共同治療脊髓半橫斷損傷發(fā)現(xiàn)：AECs主要是通過分泌神經(jīng)營養(yǎng)因子促進了脊髓損傷大鼠運動功能的恢復(fù)[4]。但由于脊髓損傷后炎癥反應(yīng)的攻擊，移植細胞的數(shù)量通常在移植后會急劇減少[5]，因此，提高移植AECs的存活率將更有利于其在脊髓損傷中的治療作用。NDGA是選擇性的5-脂肪氧化酶的抑制劑，可抑制花生四烯酸代謝，降低白細胞三烯和前列腺素的合成，從而減少炎癥反應(yīng)。研究[6]顯示：NDGA可抑制巨噬細胞活性和趨化反應(yīng)，有效避免炎癥反應(yīng)對移植體內(nèi)胰島細胞的攻擊，延長移植細胞的壽命[7]。因此，NDGA有可能延長移植入化學(xué)去細胞肌肉支架中AECs的存活時間，增加移植細胞的存活數(shù)量，促進其在脊髓損傷中的治療作用。但目前尚無NDGA治療脊髓損傷的相關(guān)報道。本研究擬將不同水平的NDGA應(yīng)用于脊髓損傷，觀察NDGA對化學(xué)去細胞肌肉支架中的AECs存活的作用，以及對損傷脊髓血管再生和內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的影響，為其在脊髓損傷中的應(yīng)用提供理論和實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、主要試劑和儀器 72只體質(zhì)量230～280g雄性Wistar大鼠和6只孕12～14d孕鼠由吉林大學(xué)白求恩醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（吉2007-0003）；含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液（Hyclone公司），多聚甲醛（北京化學(xué)試劑公司），Dil（Invitrogen生物公司），NDGA（美國Sigma公司），青霉素（華北制藥股份有限公司），蔗糖（北京化工廠），OCT包埋劑（長春博大生物公司），10%羊血清（北京鼎國生物公司），VEGF一抗（Santa Cruz生物公司），F(xiàn)ITC二抗（美國Jackson Immunoresearch Labs），BSA（北京鼎國生物公司），一抗 NG2（美國millipore公司），DAB（邁新生物公司）恒冷箱切片機（德國Leica公司）；熒光顯微鏡（日本Nikon公司）；培養(yǎng)箱（美國Nopco公司）。

1.2 大鼠AECs的分離和培養(yǎng) 取妊娠中期（12～14d）Wistar大鼠6只，以10%水合氯醛行腹腔注射麻醉，在無菌條件下剝離大鼠胚胎羊膜，用0.25%的胰酶消化并收集大鼠AECs，加入含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，細胞數(shù)以1×109L－1的密度接種至培養(yǎng)瓶中，置于37℃、5%CO2的細胞培養(yǎng)箱中靜置培養(yǎng)。移植前采用Dil標(biāo)記。

1.3 化學(xué)去細胞肌肉支架的制備 將3只 Wistar大鼠脫頸處死，行背正中切口，順椎旁肌纖維方向切取2cm×1cm×2cm大小的條形椎旁肌。將肌肉放于蒸餾水中，在搖床中以37℃、50r·min－1搖48h；之后再轉(zhuǎn)入3%Triton X-100溶液，于搖床中37℃、50r·min－1搖48h；再轉(zhuǎn)入蒸餾水中，以37℃、50r·min－1搖床中搖48h；然后放入1%SDS溶液，于搖床中37℃、50r·min－1搖48h；再放入PBS中于搖床中清洗24h，中間換液。最后按肌纖維方向修剪整齊后放入PBS中4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 動物分組及給藥 將72只成年雄性大鼠隨機分成生理鹽水組和20、30、40mg·kg－1DNGA組，每組18只。每組分別于術(shù)后1、2和4周隨機選取6只大鼠進行取材。生理鹽水組：去細胞肌肉支架聯(lián)合AECs移植治療大鼠脊髓半切損傷，腹腔注射生理鹽水；20mg·kg－1NDGA組：去細胞肌肉支架聯(lián)合AECs移植治療大鼠脊髓半切損傷，腹腔注射20mg·kg－1NDGA；30mg·kg－1DNGA組：去細胞肌肉支架聯(lián)合AECs移植治療大鼠脊髓半切損傷，30mg·kg－1NDGA腹腔注射；40mg·kg－1NDGA組：去細胞肌肉支架聯(lián)合AECs移植治療大鼠脊髓半切損傷，40mg·kg－1NDGA腹腔注射。

1.5 大鼠脊髓半橫斷損傷模型制備與化學(xué)去細胞肌肉支架聯(lián)合AECs的移植治療 取生長良好的大鼠AECs，待70%融合時，用 Hank’s液沖洗2次，加入體積分?jǐn)?shù)為0.5mL·L－1Dil的Hank’s液，置于4℃、15min，再移入37℃培養(yǎng)箱中5min，Hank’s液沖洗后室溫下以0.125%胰蛋白酶消化。離心去除胰酶，用DMEM培養(yǎng)液重懸并調(diào)節(jié)細胞密度為2×106mL－1。將AECs移入EP管中放入37℃培養(yǎng)箱中待用。取成年雄性Wistar大鼠3只，采用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，暴露T9－T10段脊髓，用虹膜剪剪下右半側(cè)約2mm長的一段脊髓。將支架修剪至合適大小，用1mL注射器吸入AECs懸液，注入0.2mL細胞懸液于去細胞肌肉支架中。于缺口處植入移植物，在移植物上方用保鮮膜覆蓋以固定移植物，然后逐層封閉傷口。術(shù)后各組大鼠分別給予生理鹽水和20、30、40mg·kg－1NDGA腹腔注射1周，并且各組大鼠應(yīng)用青霉素腹腔注射常規(guī)抗感染1周。

1.6 各組大鼠支架中的AECs數(shù)量的檢測 各組大鼠分別于術(shù)后1、2和4周各取6只，采用10%水合氯醛行腹腔麻醉，生理鹽水、4%多聚甲醛灌流固定、暴露脊髓T8～T12、迅速取出脊髓組織、于4%多聚甲醛后固定4h、蔗糖梯度脫水、OCT包埋、－70℃保存。用恒冷箱切片機行冠狀切片，厚16μm，甘油封片。熒光顯微鏡下觀察支架中AECs數(shù)量，并根據(jù) Taylor[2]和 Pan[8]的方法進行計數(shù)，具體如下：每只動物選5張切片（間距80μm），每張切片隨機選6個高倍鏡視野進行計數(shù)，之后用5張切片的平均值作為該動物的陽性細胞數(shù)，計數(shù)各時間點每組6只動物的平均值。

1.7 免疫熒光組織化學(xué)法觀察各組大鼠血管再生情況 取各組大鼠術(shù)后1周的切片，每隔7張取1張，經(jīng)10%羊血清封閉30min，VEGF一抗（1∶100稀釋）4℃孵育過夜，PBS沖洗，二抗（FITC標(biāo)記羊抗小鼠，1∶400稀釋）室溫孵育1h，PBS沖洗，甘油封片。在熒光顯微鏡下觀察并計數(shù)：計數(shù)移植區(qū)周圍但不包括移植區(qū)的血管面積百分比。每只動物選5張切片（間距80μm），每張切片隨機選6個高倍鏡視野照片，采用圖像處理軟件IPP6計算其血管陽性面積百分比，之后用5張切片的平均值作為該動物的陽性面積百分比，計數(shù)每組6只大鼠的血管陽性面積百分比的平均值。

1.8 免疫組織化學(xué)法觀察各組大鼠內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的數(shù)量 各組大鼠于術(shù)后1周灌流、固定、包埋和切片，每隔7張取1張切片，依次經(jīng)PBS沖洗、0.01%Triton X-100打孔，PBS 沖洗，0.3%H2O2滅活，5%BSA封閉30min，羊血清封閉30min，加入一抗NG2（1∶100稀釋）4℃孵育過夜，PBS沖洗，加入二抗、HRP標(biāo)記的三抗，室溫孵育10min，PBS沖洗，DAB顯色。普通光學(xué)顯微鏡觀察NG2陽性內(nèi)源性神經(jīng)干細胞并計數(shù)，計數(shù)移植區(qū)周圍NG2陽性細胞。每只大鼠選5張切片（間距80μm），每張切片隨機選6個高倍鏡視野計數(shù)其NG2陽性細胞數(shù)，之后用5張切片的平均值作為該動物的NG2陽性細胞數(shù)，計數(shù)每組6只大鼠NG2陽性細胞數(shù)的平均值。

1.9 統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)處理。AECs陽性細胞計數(shù)、血管陽性面積百分比和NG2陽性細胞計數(shù)以±s表示，組間比較采用One-way ANOVA。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠移植物中AECs數(shù)量 移植后1、2和4周，各組大鼠AECs分別為：生理鹽水組，74.17±12.64、57.17±19.68和31.83±10.50；20mg·kg－1NDGA組，107.50±48.64、85.33±32.38和41.67±13. 53；30mg·kg－1NDGA組，291.67±31.66、233±30.44和134.50±32.69；40mg·kg－1NDGA 組，280.50±49.45、230±54.85和120.33±33.97。隨著時間的延長，各組大鼠AECs的數(shù)量均逐漸減少，到第8周時，4組大鼠AECs均完全消失。同一時間點，與生理鹽水組比較，20mg·kg－1NDGA組大鼠存活的AECs數(shù)無明顯差別，而30和40mg·kg－1NDGA組大鼠存活的AECs數(shù)量明顯高于生理鹽水組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1（插頁二）。

2.2 術(shù)后1周各組大鼠支架周圍脊髓血管 各組大鼠術(shù)后1周的VEGF免疫熒光染色檢測，與生理鹽水組（4.79%±0.40%）比較，隨著NDGA濃度的逐漸增加，各組大鼠血管陽性面積百分比逐漸下降，20mg·kg－1NDGA組大鼠血管陽性面積百分比（4.08%±0.72%）最大，30mg·kg－1NDGA 組 大 鼠（2.98% ± 0.35%） 次 之，40mg·kg－1NDGA組大鼠血管陽性面積百分比（2.22%±0.26%）最小，20mg·kg－1NDGA組與生理鹽水組間血管陽性面積百分比的差異無統(tǒng)計學(xué)意義外，其他各組間的差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2（插頁二）。

2.3 術(shù)后1周各組大鼠支架周圍脊髓組織內(nèi)源性神經(jīng)干細胞 術(shù)后1周的NG2免疫組織化學(xué)染色檢 測 結(jié) 果：生 理 鹽 水 組（70.00±10.04）、20mg·kg－1組（64.17±14.65）、30mg·kg－1組（63.83±12.78）和 40mg·kg－1組（55.17±11.87）之間大鼠NG2陽性細胞數(shù)比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖3（插頁二）。

3 討 論

本研究發(fā)現(xiàn)：NDGA可以增加移植入脊髓損傷處化學(xué)去細胞肌肉支架內(nèi)AECs的存活數(shù)量，對脊髓損傷后的NG2陽性內(nèi)源性神經(jīng)干細胞無影響，但隨應(yīng)用劑量的增加可抑制新生血管的形成。這些證據(jù)提示應(yīng)用NDGA能夠促進脊髓損傷處移植細胞的存活，對改善細胞移植治療脊髓損傷的效果具有重要意義。

NDGA的應(yīng)用有利于AECs的存活，為治療脊髓損傷促進移植細胞的存活提供了有效的手段。脊髓損傷早期的炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致移植細胞死亡的主要原因。脊髓損傷后的炎癥反應(yīng)在損傷后1周內(nèi)反應(yīng)最強，之后逐漸減弱[9]。所以，為避免炎癥反應(yīng)對細胞存活和分化的影響，Okano等[10]建議將細胞移植的時間放在損傷后1周。但脊髓損傷后及時的治療對于運動功能恢復(fù)具有重要意義。比如紅核神經(jīng)元逆向運輸在脊髓損傷3d后就消失[11]，因此如果細胞移植的時間選擇在脊髓損傷后1周，那么移植細胞分泌的神經(jīng)營養(yǎng)因子就不能有效地促進紅核脊髓束的再生。可見抑制脊髓損傷后早期的炎癥反應(yīng)對于細胞移植促進損傷脊髓的功能恢復(fù)具有重要的意義。有研究[12]證實：參與脊髓損傷早期炎癥反應(yīng)的主要細胞為巨噬細胞、中性粒細胞、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor alpha，TNF-α）和 白 細 胞 介 素 1β（interleukin-1beta，IL-1β）等炎癥因子。本課題組研究[6]表明：NDGA能夠抑制脊髓損傷早期巨噬細胞和中性粒細胞的浸潤以及炎癥因子的表達，從而減輕脊髓損傷早期的炎癥反應(yīng)。所以，NDGA可能促進移植到脊髓損傷大鼠體內(nèi)AECs的存活。本研究結(jié)果顯示：30和40mg·kg－1NDGA 明顯地促進了大鼠AECs的存活，與20mg·kg－1NDGA組及生理鹽水組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義，這說明NDGA只有達到一定量后才對移植細胞的存活具有促進作用。同時也說明NDGA本身對移植細胞無毒性作用。所以，在脊髓損傷的治療中，應(yīng)用NDGA促進移植細胞的存活是一種安全有效的方法。

NDGA對損傷脊髓內(nèi)源性神經(jīng)干細胞無影響，使其應(yīng)用于脊髓損傷的治療成為了可能。脊髓損傷后，有髓神經(jīng)纖維的再生對于損傷脊髓運動功能的恢復(fù)具有重要意義。參與髓鞘再生修復(fù)的主要細胞來源是Olig2陽性的少突膠質(zhì)細胞的前體細胞，而這些細胞來自于表達NG2陽性內(nèi)源性脊髓神經(jīng)干細胞的分裂增生[13]。所以，NG2陽性內(nèi)源性神經(jīng)干細胞或少突膠質(zhì)細胞前體細胞的增生、存活和分化受阻均會導(dǎo)致脊髓損傷后髓鞘再生障礙。然而NDGA的生物學(xué)作用不僅能夠抑制炎癥反應(yīng)，而且還具有抑制腫瘤生長的作用，所以NDGA可能抑制NG2陽性內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增生、存活和分化。故本研究觀察了NDGA對NG2陽性內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖的影響，以確定NDGA治療脊髓損傷的潛在副作用。本研究結(jié)果證實：與生理鹽水組比較，不同濃度NDGA組大鼠NG2陽性內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的數(shù)量差別不明顯。說明NDGA對NG2陽性內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增生、存活和分化無影響。所以，NDGA在脊髓損傷的治療中具有良好的應(yīng)用前景。

NDGA對血管再生有抑制作用，故選擇NDGA治療脊髓損傷的合適劑量是關(guān)鍵。脊髓損傷后，組織工程支架作為橋接脊髓的2個斷端和移植細胞的載體是必不可少的。然而血運重建是損傷脊髓神經(jīng)纖維再生和功能恢復(fù)的基礎(chǔ)。本課題組前期工作[14]已經(jīng)證實：化學(xué)去細胞肌肉支架移植到損傷脊髓中能夠被良好的血管化，使遷入的細胞獲得足夠的營養(yǎng)，修復(fù)損傷組織。然而有研究將不同濃度的NDGA加入雞胚神經(jīng)節(jié)中觀察雞胚神經(jīng)節(jié)的血管生成情況時發(fā)現(xiàn)：NDGA對血管生成有明顯的抑制作用，并且隨著濃度的增加抑制作用更明顯[15]。因此，本研究也觀察了不同濃度NDGA對脊髓損傷后血管生成情況的影響，以便篩選出NDGA應(yīng)用的最佳用量。本研究結(jié)果證實：支架周圍脊髓組織內(nèi)的新生血管受NDGA的影響，且隨著NDGA濃度的增加新生血管陽性面積百分比逐漸下降。但是，根據(jù)本研究中AECs和NG2陽性內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的存活情況判斷，NDGA的短時應(yīng)用（損傷后1周）造成的血管陽性面積的減少并不會影響細胞的存活。NDGA可以成為輔助生物支架和細胞移植聯(lián)合治療脊髓損傷的理想的生物分子。

綜上所述，NDGA有可能成為改善移植細胞存活從而輔助治療脊髓損傷的有效藥物。

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