劉 姝，王霽雪，吳雅臻，王淑梅

（吉林大學(xué)第二醫(yī)院眼科，吉林 長春 130041）

增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變（proliferative vitreoretinopath，PVR）常會導(dǎo)致嚴(yán)重的視力損害，但現(xiàn)有治療手段效果均不理想。隨著對PVR病因?qū)W的深入了解，基因治療PVR成為研究的焦點。色素上皮源性因子（pigment epitheliumderived factor，PEDF）是新近發(fā)現(xiàn)的一種蛋白質(zhì)，因其具有多種生物活性，近年來得到了廣泛關(guān)注。Ogata等[1]發(fā)現(xiàn)：PVR患者的PEDF濃度低于孔源性視網(wǎng)膜脫離患者，說明PEDF可能有抑制PVR的功能，其具體機制尚不清楚。另有大量研究[2－4]結(jié)果顯示PEDF對參與PVR形成的多種細(xì)胞及因子均起到了抑制作用：①PEDF對視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞（retinal pigment epithelial cell，RPE）增殖及分化有調(diào)節(jié)作用。而PEDF的下降可導(dǎo)致RPE細(xì)胞退化、變性。這可能主要是通過對細(xì)胞周期的阻滯，將RPE細(xì)胞阻滯在G0期，阻止其重新進入細(xì)胞周期，從而達到抑制細(xì)胞增殖的作用。②PEDF對Müller細(xì)胞也有影響，PEDF下降會導(dǎo)致Müller細(xì)胞的形態(tài)、超微結(jié)構(gòu)和功能發(fā)生改變[5－6]。③PEDF可以完全抑制由集落刺激因子引起的小膠質(zhì)細(xì)胞的分裂。通過改變了小膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)，使其變?yōu)椴换顒訝顟B(tài)，并通過小膠質(zhì)細(xì)胞間接抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞的增殖[7]。④PEDF還可以抑制巨噬細(xì)胞增殖以及巨噬細(xì)胞誘發(fā)的炎癥反應(yīng)[8－9]。⑤PEDF亦能增加血管內(nèi)皮細(xì)胞表達FasL[10]，通過FasL誘導(dǎo)黏附在血管壁上的白細(xì)胞凋亡，抑制白細(xì)胞外滲。⑥PEDF作為血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的拮抗因子[11－12]，可以抑制 VEGF的促生長和移行活性。雖然大量研究間接提示了PEDF可能有抑制PVR的作用，但并無相應(yīng)的動物實驗研究報道。本研究探討藉由基因轉(zhuǎn)染技術(shù)，觀察PEDF對PVR形成的影響，初步揭示PEDF在PVR形成過程中發(fā)揮的作用，旨在為進一步研究PEDF對PVR形成影響的機制和最終找到臨床上治療PVR的新手段提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑和儀器

40只健康雄性SD大鼠，體質(zhì)量約200g，由吉林大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK（吉2007-0003）；pcDNA3-PEDF質(zhì)粒為本文作者于前期研究[13]中構(gòu)建，陽離子脂質(zhì)體Dosper為BoeJuinger Mamdaeim公司產(chǎn)品，抗人PEDF單克隆抗體為R＆D公司產(chǎn)品；隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海），臺式高速離心機（TGL-16G，北京），眼科顯微手術(shù)器械包（蘇州）。

1.2 PVR模型的制備

1.2.1 大鼠腹腔巨噬細(xì)胞的提取 將4只SD大鼠剃去腹部的毛并消毒。腹腔注射10mL無菌液體石蠟，3～4d后收集腹腔細(xì)胞。放血處死動物，以減少腹腔中的紅細(xì)胞。消毒腹部，沿腹中線注入10mL冰中預(yù)冷的無菌PBS-H（含10U·mL－1肝素和10%小牛血清的PBS）。輕輕按摩腹部5min。以下均無菌操作。剪開腹壁，用吸管吸出滲出液，再用同樣容量的預(yù)冷PBS-H沖洗腹腔2～3次。合并滲出液于離心管中，4℃、250g離心10min，棄上清液。用預(yù)冷的RPMI-1640培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3次，每次4℃、250g離心10min，棄上清液。用預(yù)冷的適量RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺盼藍染色計數(shù)細(xì)胞。

1.2.2 貼壁法純化大鼠巨噬細(xì)胞 用含20%～40%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液將巨噬細(xì)胞配成（2～4）×106mL－1。以每平方厘米（2～4）×105個巨噬細(xì)胞的密度將細(xì)胞懸液接種至培養(yǎng)皿中。于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)1h。搖晃培養(yǎng)皿，懸浮未黏附細(xì)胞，吸出細(xì)胞懸液。用預(yù)溫的 Hank’s液洗滌細(xì)胞3～4次。用含2.5mmol·L－1EDTA的無鈣鎂 Hank’s液消化細(xì)胞37℃、20min。用吸管吹打分離細(xì)胞，250g離心10min，棄上清液。用預(yù)冷的Hank’s液洗滌細(xì)胞3～4次，每次離心250g×10min，棄上清液。最后用含10%小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞，臺盼藍染色計數(shù)細(xì)胞，將細(xì)胞配成8×106mL－1，立即使用。

1.2.3 玻璃體注射活化巨噬細(xì)胞誘發(fā)PVR模型

SD大鼠按每公斤體質(zhì)量腹腔注射1%戊巴比妥鈉30mg進行麻醉，1%丁卡因眼液滴眼，1%阿托品散瞳。顳上方剪開角鞏膜緣處球結(jié)膜，距角鞏膜緣3～4mm分離成1/2厚鞏膜瓣，于剝離的鞏膜瓣下方距角鞏膜緣后2mm處向玻璃體腔中后部注入巨噬細(xì)胞懸液20μL，再于角鞏膜緣后2mm處穿刺鞏膜長1.5mm，刺入深度為2mm，結(jié)膜瓣覆蓋，結(jié)膜囊內(nèi)涂抗生素眼膏。

1.3 動物分組及處理

36只清潔級SD大鼠（體質(zhì)量約200g）隨機分為PVR對照組、PVR生理鹽水玻璃體腔注射對照組（鹽水對照組）和PVR pcDNA3-PEDF玻璃體腔注射組（轉(zhuǎn)染組），每組12只。每組大鼠的右眼為實驗眼，左眼作為陰性對照眼。PVR對照組：大鼠右眼玻璃體腔注射巨噬細(xì)胞，具體步驟見前述“1.2PVR模型的制備”。鹽水對照組：SD大鼠按每公斤體質(zhì)量腹腔注射1%戊巴比妥鈉30mg麻醉，1%丁卡因眼液滴眼。手術(shù)顯微鏡下右眼玻璃體腔內(nèi)注射生理鹽水15μL。于注射生理鹽水3d后，右眼玻璃體腔注射巨噬細(xì)胞，具體步驟見“1.2.3”。轉(zhuǎn)染組：SD大鼠按每公斤體質(zhì)量腹腔注射1%戊巴比妥鈉30mg麻醉，1%丁卡因眼液滴眼。手術(shù)顯微鏡直視下先剪開大鼠右眼球結(jié)膜，于睫狀體平坦部垂直刺入微量進樣器，并盡量將針頭接近對側(cè)視網(wǎng)膜表面，注入15μL脂質(zhì)體-DNA混合物（將1.5μg質(zhì)粒DNA溶于7.5μL生理鹽水中，再加7.5μL脂質(zhì)體混勻，靜置30min）。于玻璃體腔內(nèi)轉(zhuǎn)染pcDNA3-PEDF 3d后，右眼玻璃體腔注射巨噬細(xì)胞，具體步驟見 “1.2.3”。

1.4 檢測指標(biāo)

分別于玻璃體腔內(nèi)注射生理鹽水或質(zhì)粒pcDNA3-PEDF后3d，采用檢眼鏡和全視網(wǎng)膜鏡觀察大鼠玻璃體及視網(wǎng)膜情況；于玻璃體腔注射巨噬細(xì)胞后3d和1、2、3、4周行檢眼鏡檢查并采用全視網(wǎng)膜鏡觀察PVR形成情況。分別于注射巨噬細(xì)胞后1、2、3和4周摘除SD大鼠眼球，固定包埋，4μm切片，HE染色，光鏡觀察標(biāo)本的玻璃體、視網(wǎng)膜各層結(jié)構(gòu)和細(xì)胞增殖情況。

2 結(jié) 果

2.1 各組大鼠PVR 形成情況

玻璃體腔內(nèi)注射生理鹽水或質(zhì)粒pcDNA3-PEDF后3d，鹽水對照組和轉(zhuǎn)染組大鼠均可見玻璃體無明顯混濁，眼底清晰，視網(wǎng)膜平伏；玻璃體腔注射巨噬細(xì)胞后3d，可見3組大鼠玻璃體腔內(nèi)均有明顯的霧狀混濁，眼底隱約可見視網(wǎng)膜平伏。注射后1周見3組大鼠玻璃體腔內(nèi)均有輕度的霧狀混濁，眼底可見視網(wǎng)膜平伏。PVR對照組和鹽水對照組大鼠可見玻璃體腔內(nèi)條索狀增殖膜。注射后2周3組大鼠玻璃體霧狀混濁基本消失，PVR對照組和鹽水對照組大鼠可見明顯增殖改變，2組大鼠中各有1鼠（1眼）出現(xiàn)網(wǎng)膜牽拉隆起；轉(zhuǎn)染組大鼠玻璃體無明顯混濁，眼底清晰，視網(wǎng)膜平伏。注射后3周PVR對照組和鹽水對照組大鼠玻璃體腔有明顯增殖改變，有條索狀增殖物牽引網(wǎng)膜，其中PVR對照組1鼠（1眼），鹽水對照組2鼠（2眼）出現(xiàn)牽拉網(wǎng)脫；轉(zhuǎn)染組大鼠中1鼠（1眼）可見玻璃體腔內(nèi)牽拉條索，余實驗眼玻璃體腔和視網(wǎng)膜未見明顯異常。注射后4周見PVR對照組和鹽水對照組大鼠均出現(xiàn)牽拉網(wǎng)脫，玻璃體腔內(nèi)增殖明顯；轉(zhuǎn)染組大鼠可見1鼠（1眼）出現(xiàn)玻璃體牽拉，視網(wǎng)膜淺脫離，余實驗眼玻璃體無明顯混濁，眼底清晰，視網(wǎng)膜平伏。大鼠陰性對照眼玻璃體和眼底正常。見圖1（插頁三）。

2.2 各組大鼠視網(wǎng)膜和玻璃體形態(tài)學(xué)

轉(zhuǎn)染組大鼠視網(wǎng)膜各時間段均表現(xiàn)為各層細(xì)胞結(jié)構(gòu)清晰，僅1眼發(fā)生視網(wǎng)膜淺脫離，可見視網(wǎng)膜前增殖膜，伴少量炎性細(xì)胞浸潤。PVR對照組和鹽水對照組大鼠可見隨病程進展的炎癥反應(yīng)，玻璃體腔注射巨噬細(xì)胞1周后可見炎癥反應(yīng)最嚴(yán)重，玻璃體內(nèi)炎癥細(xì)胞聚集，并出現(xiàn)成纖維細(xì)胞；注射2周后見玻璃體內(nèi)炎癥細(xì)胞浸潤，成纖維細(xì)胞增殖，形成膠原纖維，脫離的視網(wǎng)膜組織結(jié)構(gòu)不清；注射3周后見成纖維細(xì)胞大量增殖，膠原增加形成瘢痕，視網(wǎng)膜大部分脫離，視網(wǎng)膜各層組織被纖維結(jié)締組織代替；注射4周后見眼球萎縮，玻璃體腔內(nèi)成纖維細(xì)胞過度增殖纖維化，視網(wǎng)膜脫離、聚集、結(jié)構(gòu)不清。見圖2（插頁三）。

3 討 論

PVR是在孔源性視網(wǎng)膜脫離或視網(wǎng)膜復(fù)位手術(shù)后和眼穿通傷后，由于玻璃體內(nèi)及視網(wǎng)膜表面的細(xì)胞增生和收縮，造成牽引性視網(wǎng)膜脫離。過去的十多年內(nèi)，經(jīng)玻璃體手術(shù)治療PVR已日趨成熟，成功率顯著提高，但術(shù)后仍有一些患者PVR復(fù)發(fā)，其原因主要與前部增生性玻璃體視網(wǎng)膜病變有關(guān)。對于玻璃體切除術(shù)后復(fù)發(fā)PVR者，再手術(shù)的成功率較低，且易導(dǎo)致最終視力喪失。鑒于以往報道中PEDF對參與PVR形成的多種細(xì)胞和因子的綜合抑制作用，本實驗選擇應(yīng)用PEDF進行基因治療。以往應(yīng)用PEDF進行基因治療通常使用病毒載體，而本研究選擇脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒DNA，與重組病毒比較具有操作簡便、可以容納更大的插入序列、容易產(chǎn)生、整合和擴散危險小等特點[14]，因此可以在動物模型細(xì)胞增生活躍的時間內(nèi)達到治療作用，避免重復(fù)注射。本研究在轉(zhuǎn)染組大鼠玻璃體腔內(nèi)注射巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)PVR形成前3d即進行了重組hPEDF基因的轉(zhuǎn)染，而未采用同期注射，是考慮到鼠眼玻璃體腔內(nèi)容積有限，大量液體注入會造成眼內(nèi)壓急劇增高，導(dǎo)致眼組織的損傷，同時也降低了轉(zhuǎn)染的效率。盡管大量研究表明脂質(zhì)體介導(dǎo)玻璃體腔注射轉(zhuǎn)染的基因可在24h內(nèi)即出現(xiàn)明顯表達，本研究選擇了提前3d進行轉(zhuǎn)染，結(jié)果顯示分期注射未對大鼠眼組織造成明顯損傷，轉(zhuǎn)染的PEDF可在PVR動物模型細(xì)胞增生期內(nèi)持續(xù)表達，因而通過此種方法可以達到有效的預(yù)防作用。對于脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染的安全性，已有研究者[15]通過電鏡觀察證實：Dosper可轉(zhuǎn)導(dǎo)質(zhì)粒外源基因至活體鼠眼組織，且不會導(dǎo)致眼球結(jié)構(gòu)的改變和眼內(nèi)炎癥。本實驗也觀察到Dosper介導(dǎo)重組hPEDF基因玻璃體腔注射轉(zhuǎn)染對眼組織無明顯毒性作用，同時PEDF因其自身的神經(jīng)營養(yǎng)功能，本身亦可起到對視網(wǎng)膜的保護作用[16]。

本研究初步證實了PEDF對巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的PVR形成有抑制作用。PEDF作為一種內(nèi)源性蛋白，組織相容性較好，對視網(wǎng)膜無明顯毒性，通過玻璃體腔注射轉(zhuǎn)染可以在眼組織局部發(fā)揮作用。因此，應(yīng)用PEDF基因轉(zhuǎn)染作為抑制PVR的一種新的方法，為臨床治療PVR開辟了新的思路。

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