王 珊 綜述， 王 蕾 審校

(1.蘇州大學(xué)，江蘇蘇州215006;2.上海中醫(yī)藥大學(xué)附屬龍華醫(yī)院檢驗(yàn)科，上海200032)

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)可引起人類發(fā)生急、慢性HBV感染，其中乙型肝炎表面抗原(HBsAg)是診斷HBV感染的重要標(biāo)志。乙型肝炎表面抗體(抗HBs)則通常在HBsAg轉(zhuǎn)陰后數(shù)周，經(jīng)過一段時(shí)間的窗口期血清內(nèi)才會(huì)出現(xiàn)。抗HBs可用來預(yù)防HBV的再感染，但有賴于HBsAg與抗HBs之間的相互作用，因此HBsAg抗原性的變化可直接影響HBV感染后的診斷和治療。但近年來國內(nèi)外有關(guān)抗HBs和HBsAg共存的臨床研究報(bào)告逐漸增多［1-3］，乙型肝炎患者和無癥狀HBV攜帶者均會(huì)發(fā)生抗HBs和HBsAg同時(shí)陽性的現(xiàn)象(簡稱雙陽現(xiàn)象)。關(guān)于HBsAg與抗HBs共存機(jī)制，許多研究表明與HBsAg抗原性發(fā)生改變有關(guān)，因此我們針對(duì)HBsAg的抗原性改變與雙陽現(xiàn)象的關(guān)系做一綜述。

一、HBV基因突變與HBsAg抗原性改變

HBV基因組全長約3 200 bp，是部分雙鏈的環(huán)狀DNA，其負(fù)鏈核苷酸序列有4個(gè)相互重疊的開放讀碼框(ORF)，分別為S、C、P和X區(qū)。HBV自身編碼的DNA聚合酶具有逆轉(zhuǎn)錄酶功能，可由前基因組RNA反轉(zhuǎn)錄合成子代病毒基因組，但逆轉(zhuǎn)錄酶缺乏3'-5'的校對(duì)功能，造成子代HBV基因組與模板之間存在一定的差異，在復(fù)制過程中極易產(chǎn)生突變，高復(fù)制水平的個(gè)體每天至少發(fā)生1010次點(diǎn)突變，其突變率遠(yuǎn)高于其他DNA病毒［4］。HBV基因突變可導(dǎo)致其編碼區(qū)內(nèi)的氨基酸發(fā)生改變。氨基酸的改變可能會(huì)影響抗原的空間構(gòu)象，且氨基酸的替代位置和特性對(duì)蛋白質(zhì)構(gòu)象的影響也有差異。

(一)前 S區(qū)基因突變對(duì) HBsAg抗原性的影響

S區(qū)分為前S1、前S2和S區(qū)，S區(qū)基因編碼主蛋白，即HBsAg。前S2和S區(qū)基因共同編碼中蛋白，前Sl、前S2和S區(qū)基因共同編碼大蛋白。HBsAg由226個(gè)氨基酸組成，攜帶全部抗原反應(yīng)性;中蛋白是在主蛋白的氨基端擴(kuò)加55個(gè)氨基酸，擴(kuò)加部分為前S2蛋白;大蛋白是在中蛋白的氨基端再擴(kuò)加108～119個(gè)氨基酸，擴(kuò)加部分為前S1蛋白。

前S區(qū)基因突變常見的為前S區(qū)的缺失。前S2起始密碼缺失可使前S2蛋白不能表達(dá)。前S2突變的另一熱點(diǎn)是前S2蛋白8～22位氨基酸附近的缺失突變，該突變可影響B(tài)細(xì)胞的識(shí)別表位。這種缺失突變株普遍存在于抗HBs陽性的慢性HBV感染者中，并成為優(yōu)勢株，與逃避機(jī)體免疫反應(yīng)有關(guān)［5-6］。

前S1蛋白含有影響HBsAg分泌的調(diào)節(jié)序列，其第63～87位氨基酸或83～87位氨基酸缺失可下調(diào)HBsAg分泌。前S1突變株以前S1蛋白C端183位氨基酸缺失突變?yōu)槎嘁?，這種突變因影響HBsAg正常分泌，并使異常大蛋白發(fā)生蓄積而引起肝細(xì)胞病變。前S1區(qū)基因起始密碼下游第230位核苷酸可因突變形成終止密碼，并影響前S2起始密碼，可使HBV逃避核苷類藥物治療和宿主免疫清除。

Huang等［7］對(duì) HBsAg和抗 HBs同時(shí)陽性的慢性乙型肝炎患者前S/S區(qū)測序發(fā)現(xiàn)，前S區(qū)基因缺失在雙陽組與單純HBsAg陽性的對(duì)照組之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Wang等［8］的研究也有相同的結(jié)果，即前S區(qū)基因缺失在雙陽患者明顯多于單純HBsAg陽性者，因此推論可能前S區(qū)基因缺失與HBsAg和抗HBs同時(shí)存在密切相關(guān)。

(二)S區(qū)基因突變對(duì)HBsAg抗原性的影響

HBsAg由S區(qū)基因編碼，其優(yōu)勢共同抗原表位a決定簇位于高度保守的124～147位氨基酸親水區(qū)，是HBV各血清亞型的共同決定簇，在所有血清亞型中均存在［9］。a決定簇借2對(duì)二硫鍵形成2個(gè)環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其獨(dú)特的空間構(gòu)象使其具有極強(qiáng)的抗原性，機(jī)體產(chǎn)生的保護(hù)性抗體中90%以上針對(duì)a決定簇，該部位氨基酸的替代造成的蛋白結(jié)構(gòu)改變是HBsAg抗原性漂移產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)?？乖肿拥牧Ⅲw結(jié)構(gòu)是決定抗原與淋巴細(xì)胞抗原受體結(jié)合引起免疫應(yīng)答的關(guān)鍵，也是決定抗原與抗體結(jié)合出現(xiàn)各種免疫反應(yīng)的物質(zhì)基礎(chǔ)。若抗原立體結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，可使抗原性改變或喪失。HBsAg蛋白結(jié)構(gòu)中發(fā)生氨基酸替代后，一級(jí)結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致維持和穩(wěn)定蛋白質(zhì)三級(jí)空間結(jié)構(gòu)的各種氨基酸側(cè)鏈之間的作用平衡被打破，而形成新的平衡和空間構(gòu)象。

目前報(bào)道常見的HBV S區(qū)編碼的氨基酸突變株有G145R(G→R，即甘氨酸→精氨酸)、I126T/S(異亮氨酸→蘇氨酸/絲氨酸)、M133T(蛋氨酸→蘇氨酸)等，其中國外文獻(xiàn)報(bào)道最多的為145位點(diǎn)突變，而Wang等［3］的研究中發(fā)現(xiàn)C基因型乙型肝炎患者中126位點(diǎn)突變最常見。日本學(xué)者Ren等［10］對(duì)24例慢性感染的乙型肝炎患者的HBV S區(qū)測序發(fā)現(xiàn)，在7例C型患者中6例出現(xiàn)I126T(異亮氨酸→蘇氨酸)和S143T(絲氨酸→蘇氨酸)突變。模擬HBV S區(qū)a決定簇內(nèi)氨基酸的3D 空間結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示126、129、140、143 位點(diǎn)暴露于HBsAg空間結(jié)構(gòu)的表面。但他們認(rèn)為I126T突變對(duì)HBsAg抗原性的影響比較大，首先I126T突變在進(jìn)化樹中位于基因型C分支的根源;其次蛋白或多肽的抗原性與其親水性、等電點(diǎn)及構(gòu)象密切相關(guān)，一般親水性高的多肽抗原性強(qiáng)，親水性低的多肽抗原性弱。由于蘇氨酸與被替代的異亮氨酸化學(xué)性質(zhì)差異大，蘇氨酸的親水值為－0.7，而異亮氨酸的親水值為4.5，絲氨酸的親水值為－0.8，與蘇氨酸相近。因此I126T(異亮氨酸→蘇氨酸)的突變造成HBsAg抗原性明顯減弱，而S143T(絲氨酸→蘇氨酸)突變使HBsAg抗原性改變不大，而且出現(xiàn)I126T突變的患者預(yù)后較差。

Qiu等［11］對(duì)1例C基因型的慢性乙型肝炎患者的HBsAg編碼區(qū)進(jìn)行聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)擴(kuò)增，從其克隆株中選取3株126位點(diǎn)分別為異亮氨酸(I)、蘇氨酸(T)、絲氨酸(S)的菌株，并通過定點(diǎn)誘導(dǎo)法構(gòu)建126位點(diǎn)為丙氨酸(A)的突變株。他們發(fā)現(xiàn)不同的HBsAg突變株可在同一患者體內(nèi)共存，且126S突變的HBsAg的抗原性明顯降低，而126 I、126T、126A的HBsAg與抗體反應(yīng)的水平相近。免疫熒光染色發(fā)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)4種突變HBsAg的表達(dá)水平相近，因此Qiu等認(rèn)為126S突變的HBsAg抗原性明顯減低，可能導(dǎo)致慢性乙型肝炎感染中的免疫逃逸。由于I與S的親水值相差很大，發(fā)生該突變后可使HBsAg的抗原性下降。但126T突變株抗原性的變化與Ren等［10］的研究不一致，可能與Qiu的研究例數(shù)只有1例有關(guān)。

Tian等［12］通過定點(diǎn)誘導(dǎo)法構(gòu)建了HBV S基因區(qū)內(nèi) P120T、C121S、K122I、T123N、G145R 突變株并誘導(dǎo)HBsAg表達(dá)檢測其抗原性的變化。結(jié)果顯示P120T突變株與野生型HBsAg相比，與市售試劑盒反應(yīng)性相近;C121S、K122I、T123N、G145R突變對(duì)HBsAg抗原性的影響較大，與抗體反應(yīng)均明顯降低。因此他們認(rèn)為121～123位點(diǎn)氨基酸的改變對(duì)HBsAg抗原性有較大影響。

(三)P區(qū)基因突變對(duì)HBsAg抗原性的影響

P區(qū)是HBV基因中最長的ORF，位于第2 375-0-1 621位核苷酸之間。其開始段與C區(qū)重疊，中間與S區(qū)重疊，末段與X區(qū)重疊。P區(qū)某些位點(diǎn)的突變可影響HBV前基因組RNA的包裝，從而影響病毒復(fù)制。

因部分P基因區(qū)與S基因區(qū)重疊，某種S或P基因的突變可引起相應(yīng)重疊基因的突變［13-15］，很多研究者也已經(jīng)開始關(guān)注P區(qū)突變對(duì)于S區(qū)的影響，P區(qū)的突變也可能影響HBsAg的表達(dá)、分泌和特性。Torresi等［13］研究發(fā)現(xiàn)拉米夫定耐藥引起的突變會(huì)使HBsAg a決定簇下游相應(yīng)位點(diǎn)氨基酸發(fā)生改變，導(dǎo)致HBsAg的抗原性降低，與抗體識(shí)別和結(jié)合的能力也發(fā)生改變。同樣，Torresi認(rèn)為核苷類似物的廣泛應(yīng)用可引起HBsAg突變，而疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的抗體與突變抗原的結(jié)合很弱，這可能也是疫苗接種者感染的原因之一。其他研究也指出長期應(yīng)用核苷類似物可引起S基因的突變［16］。國內(nèi)學(xué)者對(duì)拉米夫定治療期間隱匿性慢性乙型肝炎與HBV重疊基因突變的相關(guān)性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)240例乙型肝炎患者經(jīng)拉米夫定治療36個(gè)月后16例患者HBsAg陰性，而HBeAg和HBV DNA仍呈陽性。測序發(fā)現(xiàn)S區(qū)a決定簇存在氨基酸突變，P區(qū)中YMDD基序出現(xiàn)YIDD突變。他們認(rèn)為在長期拉米夫定治療期間檢測不到HBsAg，可能因HBsAg結(jié)構(gòu)蛋白發(fā)生突變，與YMDD突變協(xié)同作用，使HBsAg的抗原性改變所致［17］。

Ogura等［18］對(duì)42例隱匿性慢性乙型肝炎患者HBV S基因區(qū)和與之重疊的P基因區(qū)進(jìn)行了核苷酸序列分析，發(fā)現(xiàn)24%的患者在a決定簇發(fā)生突變，而這些突變發(fā)生后沒有檢測到DNA聚合酶主要催化活性區(qū)的改變，說明該突變可能不會(huì)影響P區(qū)病毒復(fù)制的功能。但有報(bào)道［19］顯示重疊S基因突變會(huì)增強(qiáng)耐藥突變株的復(fù)制活性。

(四)C區(qū)及X區(qū)基因突變對(duì)HBsAg抗原性的影響

C區(qū)包括前C區(qū)和C區(qū)。前C區(qū)基因經(jīng)典的突變是ntGl 896A(即83位氨基酸突變)，可使前C區(qū)基因第28密碼TGG轉(zhuǎn)變?yōu)榻K止密碼TAC，導(dǎo)致前C區(qū)mRNA翻譯為HBeAg前體蛋白中斷，HBeAg合成終止。C區(qū)最常見的突變?yōu)榛竞诵膯?dòng)子(BCP)內(nèi)ntAl 762T、ntGl 764A。這種BCP雙突變影響細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子與該區(qū)的特異性結(jié)合，可降低前C mRNA的轉(zhuǎn)錄效果，導(dǎo)致HBeAg水平下降或形成血清HBeAg陰性。關(guān)于C區(qū)基因突變對(duì)HBsAg的影響，Chen等［20］對(duì)乙型肝炎患者HBV全基因序列檢測發(fā)現(xiàn)，雙陽患者BCP內(nèi)雙突變高于單純HBsAg陽性對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但未見其他相似報(bào)道，需進(jìn)一步研究來證實(shí)C區(qū)基因突變對(duì)HBsAg抗原性的影響。

HBV DNA ntl 763-ntl 770和ntl 753-ntl 772缺失均可使X區(qū)讀碼提前終止。該區(qū)編碼產(chǎn)物HBxAg是致敏細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)攻擊的靶抗原之一，血清可溶性HBxAg可調(diào)節(jié)CTL對(duì)靶細(xì)胞的免疫識(shí)別，因此 X區(qū)突變可能不利于清除HBV。至于X區(qū)基因突變對(duì)HBsAg有何影響，目前尚未見報(bào)道，值得進(jìn)一步關(guān)注。

二、糖基化與HBsAg抗原性改變

蛋白翻譯后的修飾狀態(tài)可反映其表達(dá)細(xì)胞的胞內(nèi)環(huán)境，但受病毒感染、細(xì)胞惡性化或其他環(huán)境因素的影響，胞內(nèi)代謝發(fā)生改變時(shí)會(huì)導(dǎo)致翻譯后修飾改變。糖基化是細(xì)胞表面最常見也是最重要的一種翻譯后修飾，不僅增強(qiáng)抗原耐受蛋白酶水解能力，還可在不改變基因水平情況下，導(dǎo)致抗原表位結(jié)構(gòu)改變，引起抗原改變或生成新表位［21］。

機(jī)體對(duì)抗原刺激的免疫應(yīng)答最終均由免疫分子所介導(dǎo)。免疫分子包括免疫球蛋白、細(xì)胞因子、補(bǔ)體等。這些分子中有些為細(xì)胞膜蛋白，有些為分泌性蛋白。已知絕大部分細(xì)胞膜蛋白與分泌性蛋白屬糖蛋白。因此，蛋白質(zhì)的糖基化必然影響免疫分子的結(jié)構(gòu)與功能，從而影響機(jī)體對(duì)抗原的應(yīng)答反應(yīng)。

許多病毒抗原都有糖基化的現(xiàn)象［22-23］。Ramanujam等［22］對(duì)風(fēng)疹病毒E1蛋白3個(gè)糖基化位點(diǎn)N(天冬酰胺)76、N177、N209進(jìn)行定點(diǎn)誘導(dǎo)突變，研究發(fā)現(xiàn)失去N-糖基的N76I、N209I及二者聯(lián)合的突變株轉(zhuǎn)染細(xì)胞后檢測不到感染性的風(fēng)疹病毒衣殼，而在野生型和N177I突變株感染細(xì)胞中仍可檢測到，表明N76I、N209I對(duì)風(fēng)疹病毒的可變性至關(guān)重要。除此之外，人流感病毒血凝素的N-糖基化位點(diǎn)突變分析表明N123、N149位點(diǎn)的糖基化在決定病毒生長特性方面起重要作用;丙型肝炎病毒E1糖蛋白在N196、N305位點(diǎn)的突變明顯降低了E1蛋白與E2蛋白共價(jià)結(jié)合的效率;2型登革熱病毒中N-糖基化位點(diǎn)的突變會(huì)導(dǎo)致其生長受到限制。

在HBV感染中，其3種表面蛋白均為被糖基化修飾的糖蛋白，他們是在人肝細(xì)胞的粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和高爾基體中被翻譯后修飾而糖基化的，因此和肝細(xì)胞自身合成蛋白的糖基化修飾相似。這些糖結(jié)構(gòu)不僅不能被機(jī)體免疫系統(tǒng)識(shí)別，還能阻礙對(duì)肝細(xì)胞膜上病毒蛋白抗原表位識(shí)別，使誘導(dǎo)特異性CTL應(yīng)答失敗，導(dǎo)致免疫逃逸或耐受，從而使HBV感染慢性化。HBsAg表達(dá)基因中有3個(gè)潛在的N-糖基化位點(diǎn)(氨基酸序列必須為NXT或NXS)，分別位于前S2開放讀碼起第4(隨后氨基酸序列為NTT)、第59(NHS)、第146(NCT)位，已經(jīng)明確第146位的天冬酰胺上連接著復(fù)雜的糖基［24］。

Wu等［25］采用定點(diǎn)誘導(dǎo)突變的方法構(gòu)建了HBsAg K122I、T123N、A159G、K160N 突變株，蛋白表達(dá)后經(jīng)蛋白免疫印跡法(Western blot)發(fā)現(xiàn)T123N和K160N突變抗原蛋白顯示相對(duì)分子質(zhì)量為26 000、29 000、32 000 3個(gè)條帶，野生型抗原和K122I、A159G突變抗原只顯示相對(duì)分子質(zhì)量為26 000、29 000的2個(gè)條帶，且前一組中29 000條帶顯色深，經(jīng)過衣霉素(糖基化抑制劑)處理后，蛋白印跡中只顯示26 000條帶。因此他們推測26 000、29 000條帶可能分別是不伴或伴糖基化的HBsAg，32 000可能是123、160位點(diǎn)突變后產(chǎn)生的額外的HBsAg糖基化形式。

劉文軍等［26］利用末端重疊PCR和定點(diǎn)突變技術(shù)，獲得了去除N-多糖結(jié)構(gòu)的HBsAg S區(qū)突變基因，研究發(fā)現(xiàn)無糖HBsAg與糖化HBsAg的抗原表位明顯不同。他們認(rèn)為HBsAg的N-糖基在第146位Asn位置恰好位于a決定簇的氨基酸序列內(nèi)，糖基化很可能掩蓋了a決定簇。因此，當(dāng)去除146位連接的糖基后，失去了原有的活性位點(diǎn)而暴露出新的活性位點(diǎn)，引起 HBsAg抗原性的改變。

三、小結(jié)

機(jī)體感染HBV后產(chǎn)生HBsAg，在機(jī)體的免疫壓力、藥物或其他因素的作用下可發(fā)生基因突變。當(dāng)HBV基因發(fā)生突變時(shí)，其編碼的氨基酸發(fā)生改變或影響蛋白翻譯后的修飾，導(dǎo)致HBsAg抗原性發(fā)生改變，原先產(chǎn)生的抗體無法與突變后的抗原結(jié)合，出現(xiàn)HBsAg和抗HBs共存。至于蛋白翻譯后的其他修飾，如磷酸化、甲基化等對(duì)HBsAg抗原性影響的報(bào)道目前還很少。此外，Rodriguez-Frias等［27］發(fā)現(xiàn)HBV氨基酸突變在慢性肝炎、肝硬化、肝癌中的發(fā)生率逐漸增高，并與疾病發(fā)展的程度相關(guān)，即疾病越嚴(yán)重者其氨基酸突變的數(shù)量越多。因此HBsAg突變不僅與雙陽現(xiàn)象有關(guān)，還與疾病的進(jìn)展、轉(zhuǎn)歸密切相關(guān)。我們應(yīng)對(duì)HBsAg突變的具體機(jī)制進(jìn)行更深入的探究，為臨床對(duì)乙型肝炎相關(guān)疾病進(jìn)行準(zhǔn)確和及時(shí)的診治提供有價(jià)值的信息。

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