潘 可 綜述 李崇輝，張愛(ài)群，董家鴻 審校

解放軍總醫(yī)院 全軍肝膽外科研究所，北京 100853

內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells，EPCs)，亦稱血管細(xì)胞(angioblast)，作為一種前體細(xì)胞能夠直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞(endothelial cells，ECs)。目前認(rèn)為，骨髓是內(nèi)皮祖細(xì)胞的主要來(lái)源，除此之外在血管內(nèi)膜、脾臟、心肌、脂肪和肝臟等多種組織器官中也發(fā)現(xiàn)其存在。1997年，Asahara等[1]首次從循環(huán)外周血中分離出能夠直接分化為血管內(nèi)皮的前體細(xì)胞，并為之命名為血管內(nèi)皮祖細(xì)胞。近年的研究結(jié)果表明，EPCs在外周血管疾病、心腦血管疾病、腎臟疾病、腫瘤血管的形成以及創(chuàng)傷愈合等方面均發(fā)揮顯著作用[2-5]。目前與肝臟疾病相關(guān)的EPCs研究仍處于起步階段。本文對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞的生物學(xué)特性、功能及其參與肝臟損傷修復(fù)的研究進(jìn)展概述如下。

1 EPCs概念

EPCs是一種來(lái)源于骨髓以及循環(huán)系統(tǒng)的單個(gè)核細(xì)胞，具有自我更新以及增殖并最終分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞的能力，暫無(wú)成熟的血管內(nèi)皮細(xì)胞表型標(biāo)記的表達(dá)；出現(xiàn)生理或病理等因素的刺激時(shí)能被動(dòng)員至缺氧、缺血組織并分化為內(nèi)皮細(xì)胞，促進(jìn)血管的再生[6-7]。EPCs能夠分泌多種促進(jìn)血管新生的細(xì)胞因子，其中包括血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)以及白介素-8(IL-8)等[8]。未分化的EPCs呈圓形，已分化的EPCs呈梭形或紡錘形，僅僅從形態(tài)學(xué)水平很難與其他細(xì)胞加以區(qū)別，目前對(duì)于EPCs所采取的鑒定方法主要是依靠其細(xì)胞表型標(biāo)記來(lái)進(jìn)行，但迄今并無(wú)公認(rèn)的明確統(tǒng)一的鑒定標(biāo)準(zhǔn)。表型特征為CD34+/CD133+/VEGF-R2+的細(xì)胞通常即可認(rèn)為是EPCs。近年來(lái)的研究又發(fā)現(xiàn)，起源于臍血單核細(xì)胞的CD34+/CD14-或CD34-/CD14+的細(xì)胞也可分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞[9]。

EPCs的確切生物學(xué)特性仍有待進(jìn)一步驗(yàn)證，對(duì)于它們是否可以作為一種在結(jié)構(gòu)與功能上同質(zhì)的細(xì)胞群體的討論目前仍存在爭(zhēng)議。已知骨髓是EPCs的主要而非唯一來(lái)源，目前已經(jīng)在外周血、心肌及脂肪等多種不同的組織中分離出內(nèi)皮細(xì)胞樣的干/祖細(xì)胞[10]。EPCs的來(lái)源有很多，包括Sca+骨髓成血管細(xì)胞、外周血來(lái)源CD34+/VEGF-R2+的單核細(xì)胞、CD34-側(cè)群細(xì)胞以及組織固有的前體細(xì)胞。最新觀點(diǎn)認(rèn)為，內(nèi)皮祖細(xì)胞是起源于造血干細(xì)胞或者成血管細(xì)胞亞群以及間充質(zhì)干細(xì)胞的一類異質(zhì)細(xì)胞的集合。通常說(shuō)來(lái)，骨髓來(lái)源的EPCs同時(shí)表達(dá)三種標(biāo)志物—CD34、VEGFR2(Flk-1)與CD133；而血液來(lái)源的EPCs則表達(dá)HSC、c-kit與Sca-1，隨著進(jìn)一步分化失去早期標(biāo)志物CD133進(jìn)而開(kāi)始表達(dá)VE-cadherin與von Willebrand factor(血管假性血友病因子)。

2 EPCs的功能與應(yīng)用

循環(huán)系統(tǒng)中的EPCs在正常生理?xiàng)l件下含量并不多。缺血、局部血管損傷、燒傷、創(chuàng)傷以及細(xì)胞因子等各種刺激因素均能誘導(dǎo)骨髓中的EPCs動(dòng)員進(jìn)入外周血液循環(huán)系統(tǒng)，在相關(guān)因子的趨化作用下向缺血、缺氧組織或受損部位遷移，歸巢定植于內(nèi)皮損傷處并最終增殖分化為成熟內(nèi)皮細(xì)胞。歸巢的EPCs還具有促進(jìn)相鄰內(nèi)皮細(xì)胞增殖分化的能力。此外，EPCs不僅能夠促進(jìn)血管生成，修復(fù)內(nèi)皮損傷，還具有分泌多種促血管新生的生長(zhǎng)因子的作用。

骨髓移植小鼠心肌梗死模型的組織學(xué)結(jié)果顯示，供體來(lái)源的內(nèi)皮細(xì)胞定位于梗死緣帶的血管新生區(qū)域。Adams等[11]發(fā)現(xiàn)，運(yùn)動(dòng)誘導(dǎo)冠心病患者心肌缺血時(shí)，循環(huán)系統(tǒng)內(nèi)EPCs水平升高。缺血可有效動(dòng)員EPCs遷移，這一結(jié)論目前已經(jīng)在缺血性休克、心肌缺血以及腎缺血患者和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型中得到證實(shí)。多種不同的細(xì)胞因子和趨化因子均參與EPCs的歸巢。Murayama等[12]證實(shí)在缺血部位移植含有VEGF的填充物，可引起移植部位骨髓來(lái)源EPCs的聚集，提高血管新生能力。在不同疾病或者同一疾病的不同階段，EPCs的數(shù)量與狀態(tài)會(huì)出現(xiàn)不同程度的變化。可通過(guò)檢測(cè)EPCs從而間接評(píng)估相關(guān)疾病的嚴(yán)重程度和進(jìn)展階段，如心血管疾病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)、糖尿病并發(fā)外周血管病的發(fā)病率以及抗癌藥物的療效等。目前已有少量臨床數(shù)據(jù)初步證實(shí)了自體EPCs細(xì)胞移植在急性心肌梗死方面的有效性[13]。

3 EPCs與肝臟損傷修復(fù)

3.1 EPCs用于肝纖維化治療研究 慢性肝臟損傷最終均可發(fā)展為肝纖維化、肝硬化乃至肝衰竭。肝損傷的防治已成為全球探討的嚴(yán)峻課題。目前治療肝損傷的策略主要包括以下幾個(gè)方面：促進(jìn)肝細(xì)胞的再生，纖維化發(fā)生的防治，已有纖維化水平的逆轉(zhuǎn)以及促進(jìn)正常肝結(jié)構(gòu)的形成。盡管目前已存在很多治療肝損傷的方法，但至今仍無(wú)理想的臨床治療手段?，F(xiàn)有的藥物性治療多數(shù)存在療效有限、作用靶點(diǎn)單一和體內(nèi)毒性聚積等弊端。細(xì)胞移植可作為一種損傷較小、并發(fā)癥相對(duì)較少的潛在有效途徑。參考目前EPCs在心血管與腎臟疾病領(lǐng)域初步的研究成果，試圖探索一條新的行之有效的肝臟損傷修復(fù)途徑。

骨髓來(lái)源的EPCs移植目前已被用于肝纖維化治療的研究。Taniguchi等[14]研究發(fā)現(xiàn)，在四氯化碳誘導(dǎo)的肝臟功能損傷小鼠體內(nèi)注射的EPCs可在肝細(xì)胞凋亡的病灶處大量聚集，形成血管狀結(jié)構(gòu)，明顯提高肝纖維化小鼠的存活率。Nakamura等[15]的研究結(jié)果顯示，移植單一或重復(fù)骨髓來(lái)源的EPCs后，可抑制肝星狀細(xì)胞的活化，增強(qiáng)基質(zhì)金屬蛋白酶活性，調(diào)節(jié)肝細(xì)胞增殖，從而緩解大鼠肝纖維化程度。Liu等[16]在大鼠肝纖維化模型中證實(shí)，骨髓源EPCs移植可降低α-SMA、collagenⅢ與TGF-β的表達(dá)量，而四氯化碳處理所導(dǎo)致的albumin和Ki67的水平降低則恢復(fù)至正?！，F(xiàn)有的研究結(jié)果表明，VEGF分別通過(guò)與EPCs表面的兩種受體VEGF-R1、VEGF-R2的相互作用，促進(jìn)EPCs的增殖，調(diào)節(jié)黏附分子的表達(dá)，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)EPCs的動(dòng)員；同時(shí)也可通過(guò)誘導(dǎo)造血因子如粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(G-CSF)的釋放發(fā)揮動(dòng)員作用。PDGF則可通過(guò)作用于VEGF-R1實(shí)現(xiàn)EPCs的動(dòng)員，促進(jìn)壞死部位的血管新生。此外，還有很多不同種類的生長(zhǎng)因子，包括血管生成素-1(angiogenin-1)、成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fibmblast growth factor，F(xiàn)GF)和干細(xì)胞因子(stem cell factor，SCF)等也參與促進(jìn)EPCs動(dòng)員的過(guò)程。

EPCs移植可誘導(dǎo)生成促進(jìn)肝再生、促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)的降解或抑制細(xì)胞外基質(zhì)生成的各種生長(zhǎng)因子，促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，減緩肝纖維化進(jìn)程，從而為肝臟疾病的治療提供一種前景光明的新手段。

3.2 EPCs與肝臟缺血性損傷 肝臟組織缺血損傷后，恢復(fù)血液灌流時(shí)會(huì)導(dǎo)致組織損傷進(jìn)一步加劇。肝臟外科和肝臟移植過(guò)程均不可避免此種損傷。截至目前，肝臟移植物功能喪失和小肝綜合征始終是移植醫(yī)生所面臨的兩大難題，其發(fā)生和發(fā)展與肝臟缺血性損傷的關(guān)系極為密切。EPCs移植有望成為改善肝臟缺血性損傷的潛在手段。目前對(duì)外源性或自體擴(kuò)增EPCs移植的研究主要集中于缺血組織血管新生、心血管疾病、腎臟疾病以及組織工程等幾個(gè)方面。在不同缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭徐o脈注射EPCs后，它們均可歸巢于缺血組織并促進(jìn)新生血管的生成，但是注射成熟的內(nèi)皮細(xì)胞后卻未見(jiàn)相似效應(yīng)。Kawamoto等[17]將健康人血液來(lái)源的EPCs經(jīng)靜脈途徑注射至裸鼠急性心肌梗死模型，4周后觀察發(fā)現(xiàn)毛細(xì)血管密度增加，心臟功能得以改善。Hess等[18]將綠色熒光蛋白(GFP)標(biāo)記的骨髓源EPCs移植入結(jié)扎大腦中動(dòng)脈(MCA)的大鼠卒中模型，發(fā)現(xiàn)EPCs在缺血部位的血管區(qū)域聚集，表明骨髓源EPCs參與了腦缺血內(nèi)皮細(xì)胞的再生，促進(jìn)血管新生的發(fā)生。EPCs還能顯著改善肢體的缺血狀況，Kalka等[19]在后肢缺血的裸鼠動(dòng)物模型中局部注射體外擴(kuò)增的人源EPCs后發(fā)現(xiàn)，缺血區(qū)域毛細(xì)血管密度增加，組織血供明顯改善，缺血肢體的成活率顯著提高。此外，在組織工程化微血管中接種EPCs后可以改善其生物學(xué)特性，使之更接近于正常生理狀態(tài)，減少凝血以及栓塞的發(fā)生率[20]。具體作用機(jī)制可能是通過(guò)EPCs移植恢復(fù)血管的級(jí)聯(lián)生成，從而促進(jìn)血管的新生、成熟與穩(wěn)定。

EPCs除可直接分化為血管內(nèi)皮細(xì)胞外，還能通過(guò)自分泌/旁分泌的途徑參與血管內(nèi)皮的受損修復(fù)，而其修復(fù)功效比單純給予任一種血管生成因子都更為顯著。EPCs在新生血管生成中的重要作用已在中風(fēng)、皮膚損傷、肢體及心肌缺血等多種動(dòng)物模型的研究中得到驗(yàn)證，但是對(duì)于肝臟缺血再灌注損傷的治療研究還未見(jiàn)報(bào)道。然而我們可預(yù)期在多種肝臟疾病模型、肝臟移植過(guò)程中，骨髓來(lái)源的EPCs能夠通過(guò)其病變部位的趨化性及分泌血管生成因子等特性參與血管內(nèi)皮的修復(fù)，改善肝組織損傷。

3.3 結(jié)合基因修飾的EPCs移植治療 將內(nèi)皮祖細(xì)胞作為基因治療的載體進(jìn)行創(chuàng)傷修復(fù)的研究正在進(jìn)行中，目前常用的基因包括VEGF基因、SDF-1基因、內(nèi)皮一氧化氮合成酶(eNOS)基因、端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(TERT)基因、人低氧誘導(dǎo)因子1-α(HIF1-α)基因，成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子1(FGF1)基因等等。其中體外過(guò)表達(dá)的VEGF基因可增強(qiáng)EPCs的新生血管特性，提高創(chuàng)傷后修復(fù)功能，促進(jìn)缺血?jiǎng)游锬Ｐ托律艿男纬桑鴈NOS基因則是通過(guò)動(dòng)員EPCs修復(fù)血管內(nèi)皮的損傷，抑制損傷后新生內(nèi)膜的過(guò)度增殖[21]。通過(guò)基因修飾改變細(xì)胞表型是用于改善EPCs生物學(xué)性狀的有效手段，提高對(duì)患者機(jī)體內(nèi)各種不利因素的耐受能力，改善其治療效果。與單純移植EPCs到野百合堿誘發(fā)的肺動(dòng)脈高壓大鼠相比，表達(dá)腎上腺髓質(zhì)素的EPCs移植明顯具有更好的改善作用[22]。利用人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(hTERT)可提高細(xì)胞增殖能力、延長(zhǎng)細(xì)胞壽命等特性，EPCs轉(zhuǎn)染hTERT后，可增強(qiáng)其內(nèi)膜修復(fù)與血管新生的作用，顯著挽救肢體損傷[23]。用表達(dá)VEGF-164基因的腺病毒載體轉(zhuǎn)染EPCs后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞的增殖、黏附等能力增強(qiáng)，不僅有效促進(jìn)血管新生與血流恢復(fù)，同時(shí)顯著降低了肢體壞死與離斷程度[24]。轉(zhuǎn)染FGF1基因后，EPCs原有的遷移活性、成血管能力與存活力均得到明顯增強(qiáng)，從而能夠更好地改善豬慢性心肌缺血模型中缺血區(qū)域的血液灌流情況[25]。與此同時(shí)，采用基因治療的方法也可在一定程度上避免使用藥物動(dòng)員EPCs時(shí)的全身不良反應(yīng)。

EPCs在腫瘤的血管系統(tǒng)生成方面的作用目前仍存在爭(zhēng)議?，F(xiàn)有的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已表明，在EPCs中導(dǎo)入編碼血管新生抑制因子的基因從而促使血管生成抑制劑在體內(nèi)持續(xù)表達(dá)，可以明顯抑制腫瘤的生長(zhǎng)。提示可將EPCs作為一種潛在的行之有效的細(xì)胞載體，用于轉(zhuǎn)運(yùn)抑癌基因、抗血管生成因子、抗腫瘤藥物等，靶向于腫瘤病灶以抑制腫瘤生長(zhǎng)，從而為腫瘤治療提供新一代的靶向工具，不失為未來(lái)腫瘤治療的發(fā)展方向[26]。

4 前景與展望

正常生理狀態(tài)下EPCs少量而不可或缺的存在于循環(huán)系統(tǒng)之中，一旦發(fā)生機(jī)體缺血、組織損傷和細(xì)胞因子刺激等情況，EPCs可從骨髓向靶部位動(dòng)員、分化及增殖，形成新生血管，參與內(nèi)膜修復(fù)。EPCs的這種特性在未來(lái)肝損傷修復(fù)的研究與治療領(lǐng)域具有重要的意義與廣泛的應(yīng)用前景。但目前仍然存在很多亟待解決的問(wèn)題，例如表面標(biāo)記物的確定與篩選，體外的有效分離純化，體內(nèi)的安全有效擴(kuò)增，以及避免與治療相關(guān)的各種不良反應(yīng)等。作為近年研究的熱點(diǎn)，EPCs作為肝損傷修復(fù)的新手段，有望在不久的將來(lái)用于臨床治療肝損傷。

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