許 猛 綜述 王 巖 審校

解放軍總醫(yī)院 骨科，北京 100853

隨著腫瘤遺傳學(xué)的進(jìn)步，特異基因的改變已經(jīng)在病理實(shí)驗(yàn)室的日常診斷中得以應(yīng)用。因此，分子診斷在骨腫瘤的分型中發(fā)揮著越來越重要的作用。研究表明，所有尤文氏肉瘤和近70%的低分化動(dòng)脈瘤樣骨囊腫都有染色體易位，包括EWSR1基因或USP6(TRE17)基因等。而對于骨肉瘤和高分化軟骨肉瘤，基因組的不穩(wěn)定和復(fù)雜基因組型的參與也是導(dǎo)致發(fā)病的最關(guān)鍵環(huán)節(jié)?，F(xiàn)已被證實(shí)的前列腺癌中基因融合的高發(fā)生率(79%)啟示在骨腫瘤中存在更多隱性染色體失常[1]。最近確定了兩個(gè)新發(fā)現(xiàn)的復(fù)雜融合產(chǎn)物：間葉軟骨肉瘤HEY1-NCOA2融合基因； 上皮樣血管內(nèi)皮瘤中t(1；3)(p36；q25)易位導(dǎo)致的WWTR1-CAMTA1融合，包括骨[2-5]。本綜述將介紹多種用于探索骨腫瘤基因改變的技術(shù)，并評論一些現(xiàn)存的骨腫瘤不同基因亞型的分型標(biāo)準(zhǔn)。

1 檢測細(xì)胞遺傳學(xué)變異的分子技術(shù)

1.1 傳統(tǒng)顯帶和多色熒光原位雜交技術(shù) 依賴增殖細(xì)胞中期技術(shù)，傳統(tǒng)的細(xì)胞遺傳學(xué)研究曾是探索復(fù)雜染色體改變的重要探索工具。人染色體核型分析為腫瘤相關(guān)基因結(jié)構(gòu)和數(shù)量的改變提供了全基因掃描。這些試驗(yàn)適用于探索未知的遺傳物質(zhì)改變，這些改變轉(zhuǎn)而實(shí)現(xiàn)了特征識別以及腫瘤相關(guān)染色體重排。例如復(fù)雜易位已被用于標(biāo)示斷點(diǎn)跨越基因。以細(xì)胞中期為基礎(chǔ)的人類染色體核型分析有兩個(gè)主要的局限性： 1)對有活力的分裂細(xì)胞的依賴； 2)解決的問題有限。在一些臨床環(huán)境下，新鮮有活力的標(biāo)本是不可用于試驗(yàn)的，這些就阻礙了染色體核型分析。對于大多數(shù)的實(shí)性腫瘤，染色體的復(fù)雜性是不斷改變的，細(xì)胞中期染色體的質(zhì)量較低也阻礙了相關(guān)染色體片段的識別。最新研究顯示，在預(yù)處理切除標(biāo)本不可用的情況下，培養(yǎng)粗針活檢標(biāo)本要優(yōu)于培養(yǎng)細(xì)針活檢標(biāo)本[6]。多色熒光原位雜交(M-FISH)人類染色體核型分析是通過應(yīng)用特異性全染色體著色探針組，使每個(gè)染色體都被標(biāo)記了一個(gè)特定的顏色。這種核型分析提高了染色體重排的檢測敏感性，例如，聯(lián)合二進(jìn)制比率標(biāo)簽免疫熒光原位雜交(COBRA-FISH)核型分析[7]。然而，由于價(jià)格昂貴，而且需要特殊材料，這些試驗(yàn)未被廣泛使用。從診斷學(xué)的角度，多數(shù)已被識別的易位類型的特異性診斷試驗(yàn)(FISH和RT-PCR，詳見后述)已經(jīng)得到了發(fā)展。這些診斷試驗(yàn)有著很高的敏感性和特異性，并且可以在現(xiàn)有材料上應(yīng)用。這些診斷試驗(yàn)(FISH和RT-PCR)的高選擇性排除了對結(jié)果有影響的腫瘤相關(guān)的次生改變檢測。

1.2 陣列比較基因組雜交技術(shù) 近十年，陣列比較基因組雜交技術(shù)已成為檢測基因改變(基因的延長或消失)的強(qiáng)大技術(shù)。這種技術(shù)已成功用于研究先天的(種屬性的)和后天獲得(腫瘤相關(guān))基因研究。常規(guī)應(yīng)用中的一些參數(shù)，例如陣列試驗(yàn)分辨率(芯片上報(bào)告元件的數(shù)量)、樣本特性(腐敗或新鮮)、樣本純度(腫瘤細(xì)胞比例)等都很重要。已推廣的陣列平臺最初是為掃描基因改變而設(shè)計(jì)的，因此在外顯子-內(nèi)含子水平上的個(gè)體基因改變的檢測方面所提供的信息是有限的。為了彌補(bǔ)這種局限性，人們開始應(yīng)用寡核苷酸微陣列比較基因組雜交的方法?？梢杂么朔椒z測和定位目標(biāo)基因中與外顯子大小相類似的片段改變，在后天或先天基因中都可以應(yīng)用[8-9]。這項(xiàng)技術(shù)使經(jīng)過脫鈣、甲醛固定、石蠟包埋骨組織的DNA萃取物的分析成為可能[10]。陣列比較基因組雜交技術(shù)被寄希望于可直接應(yīng)用于診斷，對于拷貝數(shù)改變的檢測，尤其是當(dāng)包括多對基因座或變化基因的長度可變時(shí)，陣列比較基因組雜交技術(shù)會優(yōu)于FISH技術(shù)。已經(jīng)證實(shí)CDKN2A/2B區(qū)域純合子缺失使各型腫瘤的預(yù)后都較差，而在實(shí)例中，常規(guī)FISH探針組檢測顯示出相反的結(jié)果。假陰性結(jié)果或許是由FISH探針覆蓋了部分基因區(qū)域的微缺失造成的。由于這些微缺失(5~10 kb)會比實(shí)際的探針(90~150 kb)小，因此在這種方法下，微缺失仍檢測不到。其他技術(shù)，如arrayCGH或多重連接依賴式擴(kuò)增技術(shù)(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)已可應(yīng)用于檢測微缺失[11-12]。這些檢測方法已在先天基因(一般的微缺失和重復(fù)綜合征基因區(qū)域)中體現(xiàn)了優(yōu)越性。另外，arrayCGH不能用于檢測平衡易位基因。

2 易位檢測

2.1 熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization，F(xiàn)ISH)FISH可以在探針覆蓋斷點(diǎn)或與斷點(diǎn)側(cè)面相接的情況下識別特異性易位。易位斷點(diǎn)則使區(qū)別標(biāo)記探針組(以紅綠常見)顯現(xiàn)出了不同顏色。如果可以得到甲醛固定、石蠟包埋的組織標(biāo)本，那么FISH就是最佳選擇。FISH最大的一個(gè)優(yōu)勢在于它可以檢測出非分裂相(細(xì)胞間期)細(xì)胞胞核內(nèi)的染色體易位，這種細(xì)胞可來源于新鮮、冰凍或甲醛固定石蠟包埋的腫瘤組織標(biāo)本。同時(shí)，F(xiàn)ISH也可用于僅有甲醛固定石蠟包埋標(biāo)本的檢測。然而，F(xiàn)ISH在石蠟包埋標(biāo)本上并不是屢試不爽的，甚至?xí)?，尤其是在?biāo)本被甲酸或醋酸脫鈣的情況下。FISH對雜質(zhì)的敏感性較RT-PCR差。用分裂FISH探針組做的診斷試驗(yàn)不能顯示易位基因的原始位置。這或許與含有EWSR1基因的腫瘤組織有很大的相關(guān)性。這個(gè)位點(diǎn)的出現(xiàn)是偶然的，并且與臨床表現(xiàn)不典型的骨腫瘤、軟組織腫瘤多樣性有關(guān)系。為了找出易位基因的準(zhǔn)確易位點(diǎn)，還應(yīng)當(dāng)進(jìn)行附加試驗(yàn)(協(xié)同定位探針組或下文介紹的在RT-PCR基礎(chǔ)上的試驗(yàn))。同時(shí)，F(xiàn)ISH試驗(yàn)結(jié)果還應(yīng)從組織學(xué)和免疫組化的角度進(jìn)行解釋。

2.2 反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(reverse transcriptase-PCR，RTPCR) 當(dāng)運(yùn)用新鮮冰凍標(biāo)本時(shí)，RT-PCR是首選試驗(yàn)。RTPCR可用于大多數(shù)易位形成的可轉(zhuǎn)錄嵌合基因的檢測。對于RT-PCR來說，RNA是必要的，且可以從冰凍腫瘤標(biāo)本中分離出來。從甲醛固定石蠟包埋的骨腫瘤組織標(biāo)本中分離RNA的過程會受到脫鈣過程的嚴(yán)重影響，因此可用冷凍標(biāo)本。這種技術(shù)的優(yōu)勢在于其只需很少一部分組織材料，使得極少量的活體組織切片和抽取物都可用。還應(yīng)當(dāng)注意到融合基因的多樣性，例如，尤文氏肉瘤有18種不同的嵌合基因轉(zhuǎn)錄物被描述為EWSR1-FLI1，這些都應(yīng)當(dāng)在設(shè)計(jì)引物時(shí)加以考慮。檢測產(chǎn)物定序需要在外顯子水平識別易位基因。RT-PCR會遺漏新的或很少出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。

2.3 突變檢測 基因中核苷酸置換的檢測方法取決于核苷酸置換是否具有復(fù)雜性、特異性，還是散在分布于編碼序列的全長。檢測一個(gè)變異序列的最直接方法就是熱點(diǎn)突變，熱點(diǎn)突變主要是用來篩選致癌基因中單核苷酸替代物。這些突變通過一種顯性機(jī)制激活基因，因此其在變異中的作用是有限的。最近報(bào)道的軟骨肉瘤IDH1熱點(diǎn)突變，即為一含有很少核苷酸替代物的基因，但是這些替代物很可能就是導(dǎo)致腫瘤發(fā)生的啟動(dòng)子[13-14]。特異的核苷酸置換可被強(qiáng)大且敏感性極高的方法檢測出來，這些方法可檢測出被非腫瘤組織(如基質(zhì)或炎性浸潤)嚴(yán)重污染的標(biāo)本中的單個(gè)核苷酸置換。這些方法包括： 水解探針實(shí)時(shí)PCR和焦磷酸測序技術(shù)，以及分光儀和斯卡帕基因分型[15-17]。每種方法致力于檢測一個(gè)既定核苷酸替代物或小基因缺失、插入基因。

抑癌基因失活的篩查通常需要非常復(fù)雜的程序(包括掃描完整基因序列)，這是由于熱點(diǎn)突變不是頻繁發(fā)生的。對于某些基因，熱點(diǎn)區(qū)域已被確定，比如TP53。這個(gè)所謂的“基因組衛(wèi)士”通常在外顯子5-外顯子8的區(qū)域突變。外顯子熱點(diǎn)突變檢測的失敗使得剩余編碼序列的篩查成為必需。預(yù)篩選可以用來識別序列變異的存在。當(dāng)下選用高分辨率溶解曲線分析法[15]。一旦一個(gè)序列變異被識別，其精確序列就可被桑格雙脫氧測序法測出。桑格測序法的敏感度不及前面所述的方法，而且必須確保腫瘤組織未受到非腫瘤細(xì)胞的嚴(yán)重污染。顯微切割使腫瘤細(xì)胞富集是必要的，或者可以使用新一代的測序技術(shù)，尤其是在很多樣本需要篩檢的時(shí)候。

1 Tomlins SA， Rhodes DR， Perner S， et al. Recurrent fusion of TMPRSS2 and ETS transcription factor genes in prostate cancer［J］.Science， 2005， 310（5748）：644-648.

2 Wang L， Motoi T， Khanin R， et al. Identification of a novel，recurrent HEY1-NCOA2 fusion in mesenchymal chondrosarcoma based on a genome-wide screen of exon-level expression data［J］.Genes Chromosomes Cancer， 2012， 51（2）： 127-139.

3 Errani C， Zhang L， Sung YS， et al. A novel WWTR1-CAMTA1 gene fusion is a consistent abnormality in epithelioid hemangioendothelioma of different anatomic sites［J］. Genes Chromosomes Cancer， 2011，50（8）： 644-653.

4 Mendlick MR， Nelson M， Pickering D， et al. Translocation t（1；3）（p36.3；q25） is a nonrandom aberration in epithelioid hemangioendothelioma［J］. Am J Surg Pathol， 2001， 25（5）：684-687.

5 Tanas MR， Sboner A， Oliveira AM， et al. Identification of a diseasedefining gene fusion in epithelioid hemangioendothelioma［J］. Sci Transl Med， 2011， 3（98）：98.

6 Walther C， Domanski HA， von Steyern FV， et al. Chromosome banding analysis of cells from fine-needle aspiration biopsy samples from soft tissue and bone tumors： is it clinically meaningful?［J］.Cancer Genet， 2011， 204（4）：203-206.

7 Szuhai K， Tanke HJ. COBRA： combined binary ratio labeling of nucleic-acid probes for multi-color fluorescence in situ hybridization karyotyping［J］. Nat Protoc， 2006， 1（1）： 264-275.

8 Szuhai K， Jennes I， de Jong D， et al. Tiling resolution array-CGH shows that somatic Mosaic deletion of the EXT gene is causative in EXT gene mutation negative multiple osteochondromas patients［J］.Hum Mutat， 2011， 32（2）： E2036-E2049.

9 Jennes I， de Jong D， Mees K， et al. Breakpoint characterization of large deletions in EXT1 or EXT2 in 10 multiple osteochondromas families［J］. BMC Med Genet， 2011， 12：85.

10 De Jong D， Verbeke SLj， Meijer D， et al. Opening the archives for state of the art tumour genetic research： sample processing for array-CGH using decalcified， formalin-fixed， paraffin-embedded tissuederived DNA samples［J］. BMC Res Notes， 2011， 4：1.

11 Mohseny AB， Tieken C， Van der Velden PA， et al. Small deletions but not methylation underlie CDKN2A/p16 loss of expression in conventional osteosarcoma［J］. Genes Chromosomes Cancer， 2010，49（12）：1095-1103.

12 Savola S， Nardi F， Scotlandi K， et al. Microdeletions in 9p21.3 induce false negative results in CDKN2A FISH analysis of Ewing sarcoma［J］. Cytogenet Genome Res， 2007， 119（1-2）：21-26.

13 Amary MF， Bacsi K， Maggiani F， et al. IDH1 and IDH2 mutations are frequent events in central chondrosarcoma and central and periosteal chondromas but not in other mesenchymal tumours［J］. J Pathol， 2011， 224（3）： 334-343.

14 Pansuriya TC， van Eijk R， d’adamo P， et al. Somatic Mosaic IDH1 and IDH2 mutations are associated with enchondroma and spindle cell hemangioma in Ollier disease and Maffucci syndrome［J］. Nat Genet， 2011， 43（12）： 1256-1261.

15 Van Eijk R， Licht J， Schrumpf M， et al. Rapid KRAS， EGFR，BRAF and PIK3CA mutation analysis of fine needle aspirates from non-small-cell lung cancer using allele-specific qPCR［J］. PLoS One， 2011， 6（3）：e17791.

16 Setty P， Hammes J， Roth?mel T， et al. A pyrosequencing-based assay for the rapid detection of IDH1 mutations in clinical samples［J］.J Mol Diagn， 2010， 12（6）： 750-756.

17 Cuppen E. Genotyping by Allele-Specific Amplification （KASPar）［J］. CSH Protoc， 2007， 2007：pdb.prot4841.