朱延明，郜 庭，張 鳳，柏 錫，才 華，紀(jì) 巍，羅 曉,3

（1.東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，哈爾濱 150030；2.塔里木大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，新疆 阿拉爾市 843300；3.中國科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，哈爾濱 150081）

大豆（Glycine max L.Merr）是重要的油料作物和糧食作物，大豆食心蟲（Leguminivora glycinivorella Mats.）在東北大豆產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生，給大豆生產(chǎn)帶來重大損失。大豆食心蟲屬鱗翅目（Lepidoptera）小卷蛾科（Olethreutidae），是大豆的主要蛀莢害蟲之一，其幼蟲專門取食大豆莢部和籽粒，增加籽粒破損率，造成蟲口和碎粒，嚴(yán)重影響大豆品質(zhì)和產(chǎn)量。防治大豆食心蟲的傳統(tǒng)策略是噴灑化學(xué)農(nóng)藥和雜交育種培育抗蟲新品種。噴灑化學(xué)農(nóng)藥防治，易破壞生態(tài)平衡造成污染環(huán)境；而雜交育種周期長、成本高，受基因資源的限制，不能在短期內(nèi)獲得理想的抗蟲新品種。通過基因工程手段進(jìn)行抗蟲新品種培育，將是大豆新品種選育和種質(zhì)資源創(chuàng)新的新方向。

蘇云金芽胞桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是一種革蘭氏陽性土壤芽胞桿菌，在形成芽胞同時(shí)能產(chǎn)生殺蟲晶體蛋白（Insecticidal crystal proteins，ICPs），又稱伴胞晶體蛋白（Parasporal crystal protein）或δ-內(nèi)毒素（δ-endotoxins）[1-2]，其對鱗翅目（Lepidoptera）、雙翅目（Diptera）、鞘翅目（Coleoptera）、膜翅目（Hymenoptera）、同翅目（Homoptera）、直翅目（Orthoptera）、食毛目（Mallophaga）等多種昆蟲以及線蟲、螨類和原生動(dòng)物等具有特異性殺蟲活性，而且各種Bt基因具獨(dú)特的殺蟲譜（Insecticide controlling spectrum）[3-4]。在眾多的Bt基因中，cry2Aa基因編碼的殺蟲晶體蛋白對鱗翅目和雙翅目幼蟲具有顯著殺蟲活性[5]，可防治大豆食心蟲等害蟲。

本研究構(gòu)建了由豆莢特異性啟動(dòng)子Pmsg調(diào)控的cry2Aa9m基因的植物表達(dá)載體pCMB2A，以抗除草劑bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對綏農(nóng)28大豆子葉節(jié)進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得抗性株系8株。經(jīng)PCR和RT-PCR檢測，結(jié)果證明cry2Aa9m基因已經(jīng)整合到大豆基因組中并得以表達(dá)。

1 材料與方法

1.1 材料

植物材料選用綏農(nóng)28大豆品種（由黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院綏化分院提供），大腸桿菌DH5α、農(nóng)桿菌EHA105和植物表達(dá)載體pCMBA（均由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院植物生物工程研究室保存），質(zhì)粒pUC57（含cry2Aa9m基因，由中國農(nóng)科院植保所提供）。

1.2 方法

1.2.1 植物表達(dá)載體pCMB2A的構(gòu)建

pUC57質(zhì)粒和pCMBA質(zhì)粒載體經(jīng)大量提取與純化后，分別用SacⅠ、XbaⅠ雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)1%TAE瓊脂糖凝膠電泳，分別回收pUC57小片段和pCMBA大片段，通過T4DNA連接酶連接這兩個(gè)片段，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5а感受態(tài)細(xì)胞，在含有Km的LB培養(yǎng)基平板上篩選轉(zhuǎn)化菌落，提取質(zhì)粒，SacⅠ、XbaⅠ雙酶切鑒定轉(zhuǎn)化子。經(jīng)鑒定的重組子命名為pCMB2A。

1.2.2 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105受體細(xì)胞

采用凍融法將已構(gòu)建的植物表達(dá)載體pCMB2A轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105，涂布在含有相應(yīng)抗生素的YEB培養(yǎng)基上培養(yǎng)，待轉(zhuǎn)化子長出后，隨機(jī)挑選兩個(gè)轉(zhuǎn)化子的單菌落作為模板，用bar基因特異性 引 物（S： 5'TCTACCATGAGCCCAGAACG 3'，AS：5'TCAAATCT CGGTGACGGGCA 3'）對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR鑒定，擴(kuò)增片段長度為570 bp，反應(yīng)條件（25 μL體系）為：94℃預(yù)變性 10 min；94℃ 30 s，58℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.3 大豆遺傳轉(zhuǎn)化

1.2.3.1 外植體制備

挑選飽滿、無病的大豆種子用氯氣滅菌16 h，再置于萌發(fā)培養(yǎng)基，光周期18 h/6 h。萌發(fā)5 d后在子葉與下胚軸連接處切開，保留0.5 cm下胚軸，縱向平均分開2片子葉，去掉上胚軸和分化的頂芽、側(cè)芽，在垂直于子葉與下胚軸連接處的有效分化部位輕劃5～7刀，造成傷口。

1.2.3.2 菌液制備

從新鮮平板上挑取含有pCMB2A質(zhì)粒的農(nóng)桿菌單菌落，接種在含Kan 50 mg·mL-1，Sm 50 mg·mL-1，Rif 50 mg·mL-1的YEP液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r·min-1振蕩培養(yǎng)48 h。取出菌液，按1∶10進(jìn)行第二次活化，28℃振蕩培養(yǎng)，增殖至OD600=0.6，4 000 r·min-1離心5 min收集菌體，用液體共培養(yǎng)基重懸后備用。

1.2.3.3 遺傳轉(zhuǎn)化及篩選

將制備好的子葉節(jié)外植體置于菌液中，28℃，150 r·min-1振蕩培養(yǎng)侵染30 min，再將侵染后的外植體進(jìn)行共培養(yǎng)；3～5 d后取出外植體，用含有250 mg·L-1Cefotaxime和50 mg·L-1Amoxicillin的液體芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基沖洗3遍，再用無菌濾紙吸掉多余液體，近軸面朝上30～45°接入不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基；14 d后轉(zhuǎn)入含2 mg·L-1Glufasinate的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)；經(jīng)過28 d的不定芽誘導(dǎo)后，將外植體接入伸長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每14 d繼代1次。

1.2.3.4 伸長芽的生根及移栽

待不定芽伸長到3～5 cm時(shí)，將其從芽基部剪下，在1 mg·mL-1的IBA中浸潤2 min后轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中；至根長到2～3 cm時(shí)開瓶馴化，2～3 d后洗凈根部培養(yǎng)基，移栽到混合土（蛭石∶珍珠巖∶上層土壤=1∶1∶1），散射光下覆膜保濕培養(yǎng)，約3～5 d后轉(zhuǎn)入正常光下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件為24℃，1 500 lx、每天光照16 h，80%濕度。

1.2.4 抗性植株的分子生物學(xué)檢測

1.2.4.1 抗性植株的PCR檢測

取大豆T0、T1代抗性植株葉片，用CTAB法提取基因組DNA；應(yīng)用cry2Aa9m基因特異性引物（S：5'ATTTGCGATGCGTACAATGTGG 3'，AS：5'CGTAAGGTTGCTGCTGAAATGC 3'）進(jìn)行 PCR檢測，擴(kuò)增片段長度為582 bp，反應(yīng)條件（25 μL體系）為：94℃預(yù)變性10 min；94℃30 s，56℃30 s，72℃30 s，35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖電泳檢測。

1.2.4.2 抗性植株的RT-PCR檢測

取大豆T1代PCR陽性植株豆莢，用RNAprep Plant Kit試劑盒提取樣品的總RNA，純化后，以SuperScriptTMⅢReverse Transcriptase試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第一條鏈，再以反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件與對照同1.2.4.1，PCR產(chǎn)物經(jīng)2.0%瓊脂糖電泳檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 植物表達(dá)載體的構(gòu)建

植物表達(dá)載體的構(gòu)建見圖1。SacⅠ和XbaⅠ雙酶切鑒定重組子，如圖2泳道3所示，切出2.0 kb和11.0 kb兩條帶。證明該質(zhì)粒確為重組質(zhì)粒，命名為pCMB2A，其篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar基因，目標(biāo)基因cry2Aa9m的上游調(diào)控區(qū)包括Pmsg啟動(dòng)子和植物翻譯起始密碼子共有序列（AACAATG），下游包括大豆常用終止密碼子TAA和一段多聯(lián)終止密碼子，以及Tnos終止子序列。

圖1 植物表達(dá)載體pCMB2A的構(gòu)建Fig.1 Construction of plant expression vector pCMB2A

圖2 植物表達(dá)載體pCMB2A的酶切鑒定Fig.2 Characterization with endonucleases of plant expression vector pCMB2A

2.2 重組載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌EHA105受體細(xì)胞

待轉(zhuǎn)化子長出后，以轉(zhuǎn)化子的單菌落為模板，用bar基因特異性引物對轉(zhuǎn)化子進(jìn)行PCR檢測。由圖3可知，泳道1～2均擴(kuò)增出約570 bp的條帶，證明重組質(zhì)粒pCMB2A已導(dǎo)入根癌農(nóng)桿菌中，可用于下一步的遺傳轉(zhuǎn)化。

2.3 抗性植株的獲得

經(jīng)農(nóng)桿菌侵染后，將外植體進(jìn)行共培養(yǎng)（見圖4A）；3～5 d后取出外植體，洗凈，轉(zhuǎn)至不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基（見圖4B）；14 d后接入含Glufasinate的芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基中進(jìn)行篩選培養(yǎng)（見圖4C）；經(jīng)過28 d的不定芽誘導(dǎo)后，將外植體接入伸長培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每14 d繼代1次（見圖4D）；待不定芽伸長到3～5 cm時(shí)，轉(zhuǎn)至生根培養(yǎng)基中（見圖4E）；根長至約2～3 cm后，馴化、移栽（見圖4F）。經(jīng)過不定芽的誘導(dǎo)及篩選、不定芽的伸長、生根誘導(dǎo)，最終從1 000個(gè)綏農(nóng)28子葉節(jié)外植體篩選獲得8株抗性植株。

圖3 植物表達(dá)載體轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌PCR鑒定結(jié)果Fig.3 PCR result of transforming Agrobacterium

圖4 大豆遺傳轉(zhuǎn)化及再生Fig.4 Transformation and regeneration of soybean

2.4 抗性植株P(guān)CR檢測

2.4.1 T0代植株P(guān)CR檢測

CTAB法提取上述抗性植株的基因組DNA。以抗性植株的總DNA為模板，質(zhì)粒pCMB2A為陽性對照，分別以水和同一品種未轉(zhuǎn)化植株的總DNA為陰性對照I和陰性對照II，進(jìn)行PCR檢測。其中4株能擴(kuò)增到與目的片段大小一致的條帶（582bp），初步獲得4株P(guān)CR呈陽性的轉(zhuǎn)化植株。PCR部分結(jié)果見圖5。

圖5 抗性植株P(guān)CR檢測Fig.5 PCR detection of Glufasinate resistant plants

2.4.2 T1代植株的PCR檢測

收獲T0代PCR陽性的轉(zhuǎn)基因植株種子15粒，播于溫室中，待長出第1片三出復(fù)葉時(shí)，提取抗性植株和未轉(zhuǎn)化植株總DNA，用cry2Aa9m基因特異性引物進(jìn)行PCR檢測。其中4株能擴(kuò)增到與目的片段大小一致的582 bp條帶，獲得4株P(guān)CR呈陽性的T1代植株。PCR結(jié)果見圖6。

圖6 T1代植株P(guān)CR檢測Fig.6 PCR detection of T1 plants

2.5 T1代植株的RT-PCR檢測

提取T1代4株P(guān)CR陽性植株和1株未轉(zhuǎn)化植株豆莢的總RNA，經(jīng)RT-PCR檢測，4株P(guān)CR陽性植株均能擴(kuò)增約582 bp相近的特異條帶，未轉(zhuǎn)化植株未能擴(kuò)增目的片段，這說明外基因在這4株P(guān)CR陽性植株中能反轉(zhuǎn)錄成cDNA。RT-PCR電泳結(jié)果見圖7。

圖7 T1代植株RT-PCR檢測Fig.7 RT-PCR detection of T1 plants

3 討 論

3.1 cry2Aa9m抗蟲基因的選擇

目前已發(fā)現(xiàn)cry2Aa基因共14種[6]，其ICPs的氨基酸序列同源性達(dá)95%以上，只是毒素稍有不同，且都具有知識(shí)產(chǎn)權(quán)。本研究所用cry2Aa9m基因是由中國農(nóng)科院植保所從蘇云金芽胞桿菌B-8-G菌株中克隆出野生型cry2Aa9基因后，再經(jīng)人工改造而獲得的在植物細(xì)胞中高效表達(dá)的一種cry基因[7]。

與其他cry基因相比，cry2Aa基因的氨基酸序列同源性只有17%～20%[8]，系統(tǒng)生物學(xué)研究表明，在早期的進(jìn)化過程中，cry2Aa基因有可能與cry11A、cry18A形成一個(gè)獨(dú)立的群體而遠(yuǎn)離其他cry基因[9]。在眾多cry基因中，cry2Aa基因以殺蟲譜廣、殺蟲效率高而著稱，其對鱗翅目和雙翅目幼蟲具有顯著的殺蟲活性。對于鱗翅目昆蟲，Cry2Aa蛋白的毒力遠(yuǎn)高于現(xiàn)在廣泛應(yīng)用的Cry1A蛋白[10-11]，而且通過BBMV結(jié)合試驗(yàn)表明[12]，Cry2Aa蛋白與Cry1A蛋白具有不同的結(jié)合位點(diǎn)，昆蟲對這兩種蛋白不容易產(chǎn)生交互抗性。

應(yīng)用基因工程技術(shù)，篩選和克隆毒力高、殺蟲譜廣的cry基因和基因組合，重組改造天然菌株基因，構(gòu)建高產(chǎn)穩(wěn)定的工程菌，擴(kuò)大殺蟲譜，增強(qiáng)殺蟲效率，是解決大豆食心蟲普遍發(fā)生的有效途徑，因而本試驗(yàn)選用獨(dú)特的cry2Aa9m基因?qū)Υ蠖惯M(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化極具應(yīng)用前景。

3.2 組織特異性啟動(dòng)子的選擇

啟動(dòng)子是決定外源基因轉(zhuǎn)錄效率的關(guān)鍵因素，選擇合適的啟動(dòng)子對于增強(qiáng)外源基因的表達(dá)量至關(guān)重要[13]。采用組成型啟動(dòng)子調(diào)控Bt基因，會(huì)導(dǎo)致殺蟲毒蛋白在植物各個(gè)部位均表達(dá)并積累，不但濃度較低，還會(huì)殺死大量有益昆蟲，而且外源基因在受體植物中非特異性的持續(xù)、高效表達(dá)往往造成浪費(fèi)，卻在需要該基因大量表達(dá)的時(shí)間或特定組織部位又因表達(dá)量過低而達(dá)不到預(yù)期效果[14]，選擇組織特異型啟動(dòng)子則可解決這一難題。在組織特異型啟動(dòng)子調(diào)控下，基因表達(dá)常常只發(fā)生在某些特定器官或組織部位，并表現(xiàn)出發(fā)育調(diào)節(jié)的特性。大豆食心蟲具有入莢后先蛀食豆莢組織的習(xí)性，使用豆莢特異性啟動(dòng)子（Pmsg）調(diào)控cry2Aa9m基因[15]，將其毒蛋白專一表達(dá)在豆莢上，則蟲食豆莢后即攝入殺蟲毒蛋白，而人食用不含該毒蛋白的大豆種子，這種策略不但可以控制大豆食心蟲的危害，還可以解決食品安全性問題。

4 結(jié)論

a.構(gòu)建了由豆莢特異性啟動(dòng)子Pmsg調(diào)控具有抗大豆食心蟲功能的cry2Aa9m基因的植物表達(dá)載體pCMB2A。

b.以抗除草劑bar基因?yàn)楹Y選標(biāo)記，通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化綏農(nóng)28大豆子葉節(jié)，獲得抗性株系8株；經(jīng)PCR和RT-PCR檢測結(jié)果證明，cry2Aa9m基因已經(jīng)整合到大豆基因組中并表達(dá)。

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