金正勛，王露露，劉海英，徐振華，曲 瑩，沈 鵬，張忠臣

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，哈爾濱 150030）

由線性直鏈淀粉和高度分支支鏈淀粉組成的淀粉是水稻籽粒中主要的能量貯藏物質(zhì)，約占糙米干重90%。因此籽粒灌漿過程主要是直鏈淀粉和支鏈淀粉的合成與積累過程。莖、葉等源器官制造的光合同化物以蔗糖形式運(yùn)輸?shù)阶蚜：?，在一系列酶促作用下形成直鏈淀粉和支鏈淀粉[1]。參與直鏈淀粉和支鏈淀粉合成的酶很多，如蔗糖合成酶、ADPG焦磷酸化酶、UDPG焦磷酸化酶、淀粉合成酶、淀粉分支酶等。其中淀粉分支酶的主要作用是剪切a-1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化為a-1，6糖苷鍵而形成葡聚糖鏈分支點(diǎn)，對稻米直鏈淀粉和支鏈淀粉合成與積累影響很大的關(guān)鍵酶之一[1-2]。由于直鏈淀粉是影響稻米蒸煮食味品質(zhì)最重要的內(nèi)在因素之一，所以圍繞淀粉分支酶活性與直鏈淀粉含量和蒸煮食味品質(zhì)的關(guān)系國內(nèi)外已進(jìn)行很多研究[3-7]。高等植物SBE基因主要包括SBE1、SBE3和SBE4幾個類型，它與作物籽粒中支鏈淀粉的合成密切相關(guān)，其中SBE1和SBE3起主導(dǎo)作用，分別調(diào)控約70%和30%的支鏈淀粉合成[8-9]。SBE基因與直鏈淀粉和支鏈淀粉含量的關(guān)系已有較多報道[10-14]。品種間有性雜交仍然是目前選育水稻新品種和雜種優(yōu)勢利用的主要方法。品種間有性雜交產(chǎn)生的后代數(shù)量性狀會產(chǎn)生超親遺傳變異。雖然過去對數(shù)量性狀遺傳規(guī)律做了大量研究，但數(shù)量性狀產(chǎn)生超親變異的分子機(jī)理方面研究甚少。因此，本研究選用以籽粒直鏈淀粉含量作為選擇指標(biāo)，從F2代起連續(xù)定向選擇培育成的籽粒直鏈淀粉含量有顯著差異的F10代，比較分析籽粒灌漿過程中親本和雜種后代籽粒直鏈淀粉含量積累和淀粉分支酶活性以及淀粉分支酶基因mRNA表達(dá)量等變化特點(diǎn)，旨在為水稻雜種后代直鏈淀粉含量產(chǎn)生超親遺傳變異的分子生化學(xué)機(jī)理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

在東農(nóng)423×藤系180（組合Ⅰ）和系選1號×通769（組合Ⅱ）中，以籽粒直鏈淀粉含量為選擇指標(biāo)，從F2代起按高低方向連續(xù)定向選擇至F7，從中選用籽粒直鏈淀粉含量差異大的后代各2個（H4、L11為組合Ⅰ；H16、L20為組合Ⅱ）及親本，2011年在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)進(jìn)行盆栽試驗，盆規(guī)格為直徑25 cm，高30 cm。4月10日播種，大棚旱育苗，5月25日插秧，每個盆插生長一致的4棵苗，正常肥水管理。抽穗時選取同一天抽穗進(jìn)行掛牌標(biāo)記，待抽穗后第10、17、24天分別取掛牌標(biāo)記的5個穗，取穗中上部灌漿一致的20粒，剝?nèi)シf殼和胚后置于凍存管中-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 淀粉含量和分支酶活性測定方法

取上述凍存的籽粒，在程方民等方法基礎(chǔ)上改進(jìn)[15]，按照章顯光等提出的冷堿液糊化后煮沸的方法測其胚乳直鏈淀粉含量[16]；采用硫酸-蒽酮法測定胚乳總淀粉含量[17]；胚乳總淀粉含量與直鏈淀粉含量差值作為支鏈淀粉含量；參照李太貴等方法測定胚乳淀粉分支酶活性，其酶活性以O(shè)D值表示[3]。

1.3 淀粉分支酶基因表達(dá)水平分析

采用Trizol法提取籽粒總RNA，以RNase-free DNaseⅠ處理，消除可能的基因組DNA污染，取純化后的RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)物用于RT-PCR。第一鏈cDNA合成采用Promega公司的M-MLV逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明進(jìn)行。以反轉(zhuǎn)錄得到的cDNA為模板，利用淀粉分支酶基因特異引物進(jìn)行擴(kuò)增（見表1），擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，然后對擴(kuò)增譜帶進(jìn)行表達(dá)豐度的比對分析。

表1 淀粉分支酶基因引物Table 1 Name of RT-PCR primer and sequence

2 結(jié)果與分析

2.1 親本及雜種后代胚乳直鏈淀粉積累特性比較

灌漿不同時期親本及雜種后代胚乳直鏈淀粉含量多重比較結(jié)果見表2。

表2 灌漿不同時期胚乳直鏈淀粉含量變化Table 2 Changes of amylose content in crossing progenies during grain filling (%)

由表2可知，后代直鏈淀粉含量與雙親比較兩個組合都有顯著差異，在組合Ⅰ中沒有超親變異，但在組合Ⅱ中有超親變異，L24的直鏈淀粉含量顯著低于低親。說明直鏈淀粉含量選擇效果因雜交組合而異，通過連續(xù)定向選擇可以選育直鏈淀粉含量超親的后代。

在灌漿過程中，不同直鏈淀粉含量親本及后代胚乳直鏈淀粉積累趨勢基本一致，表現(xiàn)為灌漿前期積累速度快，抽穗17和24 d時積累量分別已達(dá)到總直鏈淀粉含量的67.77%～85.21%和88.50%～97.60%，說明胚乳直鏈淀粉的合成和積累，主要在灌漿前、中期。

從多重比較結(jié)果可知，直鏈淀粉含量高的親本及后代在灌漿過程中合成和積累的直鏈淀粉量顯著高于直鏈淀粉含量低的親本及后代。說明胚乳直鏈淀粉合成和積累速度的快慢主要取決于遺傳因素，直鏈淀粉含量高的基因型在灌漿過程中合成和積累的直鏈淀粉量總是高于直鏈淀粉含量低的基因型。

2.2 親本及雜種后代胚乳淀粉分支酶活性比較

灌漿不同時期親本及雜種后代胚乳淀粉分支酶活性多重比較結(jié)果按組合列于表3。

由表3可知，灌漿過程中兩個組合直鏈淀粉含量不同的親本及后代胚乳淀粉分支酶活性變化趨勢基本一致，表現(xiàn)為隨灌漿進(jìn)程酶活性逐漸增加，達(dá)到峰值后又逐漸下降，除組合Ⅱ的L20外，都呈單峰曲線變化，峰值都出現(xiàn)在抽穗后第17天。

由灌漿不同時期的兩個組合親本及后代胚乳淀粉分支酶活性多重比較可知，直鏈淀粉含量高的親本及后代的酶活性均比直鏈淀粉含量低的親本及后代高，其酶活性峰值除組合Ⅰ中的H4與L11無顯著差異外，其他都有顯著差異，尤其是組合Ⅱ的L24灌漿不同時期的酶活性均顯著低于低親，組合Ⅰ中24 d的H6酶活性顯著高于高親H4。相關(guān)分析表明，灌漿不同時期胚乳直鏈淀粉含量與淀粉分支酶活性間均呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.2568、0.6149、0.5949。說明胚乳直鏈淀粉含量的合成與積累受淀粉分支酶活性的調(diào)控影響較大，通過直鏈淀粉含量的連續(xù)定向選擇可以改變雜種后代的淀粉分支酶活性。

2.3 親本及雜種后代胚乳淀粉分支酶基因mRNA表達(dá)量變化動態(tài)

灌漿不同時期親本及雜種后代3種胚乳淀粉分支酶同工型基因OsSBE1、OsSBE3及OsSBE4的mRNA表達(dá)量變化動態(tài)按組合分別示于圖1、2。

表3 灌漿不同時期親本及后代胚乳淀粉分支酶活性比較Table 3 Comparison of SBE activity in crossing progenies during grain filling(OD·grain-1·min-1)

圖1 不同灌漿時期親本及雜種后代胚乳淀粉分支酶基因mRNA表達(dá)量變化（組合Ⅰ）Fig.1 mRNA expression of gene involved in SBE on different filling stage(CombinationⅠ)

圖2 不同灌漿時期親本及雜種后代胚乳淀粉分支酶基因mRNA表達(dá)量變化（組合Ⅱ）Fig.2 mRNA expression of gene involved in SBE on different filling stage(CombinationⅡ)

由圖1、2可知，親本及雜種后代3種胚乳淀粉分支酶同工型基因OsSBE1和OsSBE3的mRNA表達(dá)量隨灌漿進(jìn)程逐漸增加，達(dá)到峰值后又逐漸下降，呈單峰曲線變化，除組合Ⅰ中L12的OsSBE3外，其余表達(dá)量峰值都出現(xiàn)在抽穗后17 d。在灌漿過程中胚乳OsSBE4基因的mRNA表達(dá)量相對比較小，除抽穗17 d時能檢測到明顯的表達(dá)量之外，其他時期未檢測到明顯的表達(dá)量。說明胚乳直鏈淀粉的合成積累主要與OsSBE1和OsSBE3基因關(guān)系密切。

2.4 親本及雜種后代胚乳淀粉分支酶基因mRNA相對表達(dá)量比較

在本試驗中抽穗后17 d是胚乳淀粉分支酶基因mRNA表達(dá)水平最高的時期。為了明確直鏈淀粉含量高低與胚乳淀粉分支酶基因mRNA表達(dá)量間的關(guān)系，計算抽穗后17 d的親本及雜種后代3種胚乳淀粉分支酶同工型基因OsSBE1、OsSBE3及OsSBE4的mRNA相對表達(dá)量，結(jié)果見表4。

表4 親本及雜種后代胚乳淀粉分支酶基因mRNA相對表達(dá)量比較Table 4 Comparison of SBE gene relative expression level in parent and hybrid progeny

由表4可知，SBE1基因在組合I中，直鏈淀粉含量高的后代H6與親本H4、L11相比mRNA表達(dá)量無顯著差異，但直鏈淀粉含量低的后代L12比低親L11顯著低，低1.2倍；在組合Ⅱ中，直鏈淀粉含量高的后代H1與高親H16相比mRNA表達(dá)量無顯著差異，但直鏈淀粉含量低的后代L24與低親L20相比mRNA表達(dá)量顯著高，高1.2倍；SBE3基因在組合I和組合Ⅱ中，直鏈淀粉含量高的后代與高親、直鏈淀粉含量低的后代與低親相比mRNA表達(dá)量都沒有顯著差異；SBE4基因在組合I中，直鏈淀粉含量高的后代與高親相比mRNA表達(dá)量沒有顯著差異，但直鏈淀粉含量低的后代與低親相比顯著低，低1.5倍；在組合Ⅱ中，直鏈淀粉含量高的后代與高親、直鏈淀粉含量低的后代與低親相比mRNA表達(dá)量都顯著高。說明根據(jù)胚乳直鏈淀粉含量連續(xù)定向選擇形成的雜種后代胚乳淀粉分支酶基因的mRNA表達(dá)量隨著胚乳直鏈淀粉含量的變化發(fā)生變化，而且能超親表達(dá)。由表5可知，胚乳直鏈淀粉含量與SBE1和SBE3的mRNA表達(dá)量呈不顯著正相關(guān)，與SBE4的mRNA表達(dá)量呈顯著負(fù)相關(guān)；胚乳淀粉分支酶活性與SBE1的mRNA表達(dá)量呈顯著正相關(guān)，與SBE3的mRNA表達(dá)量呈不顯著正相關(guān)，與SBE4的mRNA表達(dá)量呈不顯著負(fù)相關(guān)。說明直鏈淀粉含量和淀粉分支酶活性高的基因型其SBE1和SBE3的mRNA表達(dá)量也高，低的基因型其mRNA表達(dá)量也低，SBE4的表達(dá)量與此相反。

表5 胚乳淀粉分支酶基因mRNA相對表達(dá)量與直鏈淀粉含量及淀粉分支酶活性間相關(guān)系數(shù)Table 5 Correlation analysis of SBE gene relative expression,amylose content and enzymes activities

3 討論與結(jié)論

水稻中SBE3基因缺失表現(xiàn)為直鏈淀粉含量增加，支鏈淀粉含量明顯降低[10-11]。張鵬利用根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)基因技術(shù)將SBE1、SBE3的反義或RNA干擾結(jié)構(gòu)分別導(dǎo)入具有不同直鏈淀粉含量的水稻受體品種中，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)反義SBE1/SBE3和SBE3-RNAi種子直鏈淀粉含量較對照都有明顯的提高，且不同品種間差異顯著[12]。吳方喜等利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將水稻SBE1正、反義基因分別導(dǎo)入秈稻恢復(fù)系明恢81中，結(jié)果表明，轉(zhuǎn)SBE1反義基因的直鏈淀粉含量明顯上升[13]。汪結(jié)明等用轉(zhuǎn)基因方法干擾水稻SBE3基因的表達(dá)，其結(jié)果表明，導(dǎo)入的SBE3基因RNA干擾結(jié)構(gòu)降低目的基因表達(dá)，使其SBE活性在籽粒發(fā)育各時期均顯著降低，且不同株系間具有差異，兩個轉(zhuǎn)基因水稻株系各時期籽粒直鏈淀粉含量均顯著高于對照[14]。本試驗結(jié)果表明，在灌漿過程中籽粒淀粉分支酶活性和SBE基因的mRNA表達(dá)量變化呈正相關(guān)，且直鏈淀粉含量和淀粉分支酶活性高基因型其SBE1和SBE3的mRNA表達(dá)量高，低基因型其mRNA表達(dá)量低，SBE4表達(dá)量與此相反。上述國內(nèi)外研究結(jié)果和本試驗結(jié)果都說明SBE基因?qū)ψ蚜Ｖ辨湹矸酆铣纱嬖谡{(diào)控作用。由于淀粉分支酶的主要作用是剪切a-1，4糖苷鍵轉(zhuǎn)化為a-1，6糖苷鍵而形成葡聚糖鏈分支點(diǎn)[1-2]，因此SBE基因?qū)χ辨湹矸酆铣煞e累的調(diào)控可能是間接的調(diào)控，即通過參與直鏈淀粉合成相關(guān)基因的表達(dá)來影響直鏈淀粉的合成積累。

基因的表達(dá)順序是由DNA轉(zhuǎn)錄成mRNA，再以mRNA作為模板合成酶，最終通過各種酶促反應(yīng)形成表現(xiàn)型性狀。籽粒直鏈淀粉是在AGPase、GBSS、SBE等多種酶參與下合成和積累，是相關(guān)基因表達(dá)的最終產(chǎn)物。本試驗選用的直鏈淀粉含量高低不同的雜種后代是通過以直鏈淀粉含量為選擇指標(biāo)，在同一個雜交組合中連續(xù)定向選擇培育的穩(wěn)定后代。由本試驗結(jié)果可知，通過連續(xù)定向選擇不僅改變雜種后代籽粒直鏈淀粉含量和淀粉分支酶活性，而且也改變了淀粉分支酶基因的mRNA表達(dá)量。在本試驗中雜種后代胚乳直鏈淀粉含量、淀粉分支酶活性、淀粉分支酶基因mRNA表達(dá)量等三者的變化是線性同步變化，而且能超親表達(dá)。說明雜種后代胚乳直鏈淀粉含量的提高與淀粉分支酶活性提高和SBE基因mRNA表達(dá)量的增加有密切關(guān)系。通過基因終端產(chǎn)物數(shù)量的變化可以引起基因mRNA表達(dá)量的變化。至于連續(xù)定向選擇如何引起雜種后代基因mRNA表達(dá)量的變化，該變化是否與基因組中基因拷貝數(shù)或基因結(jié)構(gòu)的變化有關(guān)，有待深入研究。

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