王學(xué)東，于 洋，劉 巖，崔 琳

（東北農(nóng)業(yè)大學(xué)生命中心，哈爾濱 150030）

大豆（Glycine maxL.Merr.）隸屬于豆科（Fabaceae）蝶形花亞科（Papilionoideae）大豆屬（Glycine），一年生草本植物[1]。它是重要的糧食作物和油料作物，也是人類和動(dòng)物營養(yǎng)以及工業(yè)原料、脂肪酸和蛋白質(zhì)的重要來源[2]，在世界糧食作物構(gòu)成和國際油料作物生產(chǎn)中占有重要地位，在我國農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和食物消費(fèi)系統(tǒng)中起重要作用[3]。無限型開花大豆品種東農(nóng)434由東北農(nóng)業(yè)大學(xué)大豆研究所選育，它以高油資源作親本，經(jīng)有性雜交和后代加強(qiáng)油性測定選育而成，適合黑龍江省東南部地區(qū)種植。

雌蕊是植物重要的生殖結(jié)構(gòu)，根據(jù)植物形態(tài)學(xué)概念，構(gòu)成雌蕊的單位是心皮，無論是合生心皮還是離生心皮，均可以分化出下部能育的子房和上部不育的花柱，花柱上部擴(kuò)展形成柱頭。被子植物的有性生殖是一個(gè)復(fù)雜過程，它依賴花粉和雌蕊間的相互作用[4]。在被子植物受精過程中，花粉落到柱頭上萌發(fā)，長出花粉管，花粉管通過花柱進(jìn)入胚囊，最終完成雌雄配子的融合，由此可見花柱和柱頭在受精過程的重要作用[5]。

不同植物種類柱頭、花柱結(jié)構(gòu)存在極大差異，通常把柱頭分為干柱頭和濕柱頭2類，花柱分為實(shí)心、半實(shí)心和開放型3類[6]。不同類型的柱頭、花柱在接受花粉萌發(fā)、花粉管在花柱中的生長方式不同[7]。目前對多數(shù)植物柱頭和花柱所屬的類型已基本清楚。大豆為濕柱頭，中空花柱。但對大豆柱頭和花柱顯微結(jié)構(gòu)的研究還很少，對大豆花柱和柱頭細(xì)胞中細(xì)胞器分布情況也尚不清楚。本文對大豆柱頭和花柱的超微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，可作為大豆繁殖生物學(xué)研究內(nèi)容的重要組成部分。

1 材料與方法

1.1 材料

大豆品種東農(nóng)434（Glycinemax L.Merr.cv.Dongnong434）。

1.2 方法

試驗(yàn)材料于2011年4月29日在東北農(nóng)業(yè)大學(xué)校內(nèi)盆栽種植，并于2011年6月至7月間取植株三、四節(jié)部位不同發(fā)育時(shí)期的花蕾，剝其花萼及花瓣，將子房分別固定于pH 6.8、2.5%戊二醛固定液中。

掃描電鏡樣品制備：經(jīng)pH 6.8、2.5%戊二醛固定、0.1 mol·L-1PBS沖洗、乙醇系列脫水、叔丁醇置換，ES-2030（HITACHI）型冷凍干燥儀干燥，粘樣，E-1010（HITACHI）型離子濺射鍍膜儀鍍金膜，S-3400N（HITACHI）型掃描電鏡觀察。

透射電子鏡樣品制備：采用常規(guī)植物樣品電鏡制樣方法，經(jīng)戊二醛和四氧化鋨雙固定、乙醇系列脫水、環(huán)氧樹脂812包埋，AO-ULTRACUTE型超薄切片機(jī)切片，檸檬酸鉛和乙酸雙氧鈾雙重染色，H-7650（HITACHI）型透射電鏡觀察。

光學(xué)顯微鏡樣品制備：樣品處理與透射電鏡處理一致，然后將包埋塊用AO-ULTRACUTE型超薄切片機(jī)進(jìn)行半薄切片，切片厚度1 μm，切片用堿性品紅和甲苯胺藍(lán)進(jìn)行定性染色[8]，封片后置于DM/LS（LEICA）型光學(xué)顯微鏡下觀察并記錄圖像。

2 結(jié)果與分析

2.1 柱頭的形態(tài)結(jié)構(gòu)

從大豆柱頭的表面掃描電鏡觀察（見圖版Ⅰ-1～4），大豆的柱頭具乳突，柱頭表面上的乳突細(xì)胞接近于圓形，但柱頭與花柱交接處的乳突成棒狀，表面非常光滑，排列2～3層，一般長度為22～25 μm。柱頭表面的乳突上有分泌物存在，分泌物隨著柱頭的發(fā)育而不斷增多。柱頭表面的乳突上覆蓋一層表膜，表膜很薄、很脆弱。同時(shí)，因?yàn)榇蠖篂闈裰^，授粉后花粉粒落到柱頭表面時(shí)被大量的分泌物所包圍和覆蓋，為花粉萌發(fā)提供適宜的環(huán)境條件。

從大豆柱頭橫切面觀察（見圖版Ⅰ-5～8），細(xì)胞排列緊密，外緣表皮細(xì)胞排列整齊，呈長的棒狀；細(xì)胞壁之間有胞間連絲，細(xì)胞質(zhì)稠密，細(xì)胞核較大，細(xì)胞質(zhì)較稠密，含有大量葉綠體、質(zhì)體，質(zhì)體主要包含淀粉粒和小的稠密的脂質(zhì)，一些質(zhì)體包含蛋白晶體；液泡體積較大，大液泡內(nèi)一般沉積有電子致密的貯藏物質(zhì)，但是貯藏物質(zhì)在液泡內(nèi)存在形式不同，一類液泡內(nèi)的貯藏物質(zhì)均勻分布，另一類液泡內(nèi)的物質(zhì)則集中分布在液泡的邊緣。柱頭細(xì)胞從邊緣向中心細(xì)胞體積逐漸減小，柱頭內(nèi)部細(xì)胞的體積較小，液泡體積也較小，內(nèi)層細(xì)胞的液泡中幾乎不含沉積的電子致密物。

2.2 花柱的形態(tài)結(jié)構(gòu)

在掃描電鏡下（見圖版Ⅱ-1～3），大豆花柱成倒“J”形，靠近柱頭部分發(fā)生彎曲。花柱表皮層由角質(zhì)化的薄壁細(xì)胞構(gòu)成，細(xì)胞多為長條形，排列規(guī)則，輪廓清晰，其長軸與花柱平行?；ㄖ勘砥け砻嬗袣饪祝瑢贌o規(guī)則型，有的氣孔突出表面?；ㄖ坑斜砥っ?，柱頭下方則沒有表皮毛。

從大豆花柱橫切面觀察（見圖版Ⅱ-4），大豆花柱屬于開放型花柱即空心花柱，花柱細(xì)胞橫切面近似于橢圓形，細(xì)胞排列緊密。其中央部分有一個(gè)自上而下漸寬的中空花柱道，是一個(gè)心皮邊緣結(jié)合形成的內(nèi)部空間，花柱道一直延伸至子房中。從結(jié)構(gòu)上看（見圖版Ⅱ-5），花柱道周圍有一層通道細(xì)胞。通道細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)濃厚，細(xì)胞核較大；細(xì)胞內(nèi)分布著小而多的液泡，液泡內(nèi)含有較少的電子致密物質(zhì)；通道細(xì)胞含有豐富線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，也含有質(zhì)體，質(zhì)體包含淀粉粒和小的脂質(zhì)（見圖版Ⅱ-6）?；ㄖ幕窘M織細(xì)胞較大，細(xì)胞內(nèi)有大液泡，液泡內(nèi)貯藏物質(zhì)豐富，貯藏物質(zhì)的形態(tài)與柱頭相似（見圖版Ⅱ-7）。基本組織細(xì)胞中分布有維管束，維管束與基本組織細(xì)胞相比，較小，而且是獨(dú)立的；細(xì)胞壁之間有胞間連絲，細(xì)胞質(zhì)稠密，核糖體和線粒體較豐富，也含有粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，高爾基體和微體相對較少（見圖版Ⅲ-1～2）?；ㄖ砥ぜ?xì)胞是一層排列整齊，體積較大的薄壁細(xì)胞，表皮細(xì)胞包含大量葉綠體（見圖版Ⅲ-3～4）?；ㄖ?，無論是通道細(xì)胞還是基本組織細(xì)胞和表皮細(xì)胞，都包含豐富的淀粉粒，而且淀粉粒也包含膜結(jié)合的晶體。花柱細(xì)胞的細(xì)胞壁染色相對較淺。細(xì)胞壁上有發(fā)達(dá)的壁內(nèi)突結(jié)構(gòu)，細(xì)胞壁之間存在胞間連絲，使花柱細(xì)胞具有傳遞細(xì)胞的特征。

圖版Ⅰ 大豆柱頭顯微結(jié)構(gòu)PlateⅠMicrostructure of soybean stigma

圖版Ⅱ 大豆花柱的掃描電鏡及光鏡觀察PlateⅡ Scanning electron microscopy and light microscope view of soybean style

圖版Ⅲ 大豆花柱表皮和基本組織的超微結(jié)構(gòu)PlateⅢ Ultrastructure of epidermis and ground tissue of soybean style

3 討論與結(jié)論

大多數(shù)被子植物的柱頭都有乳突結(jié)構(gòu)。一些植物乳突結(jié)構(gòu)的角質(zhì)膜外有一層蛋白質(zhì)表膜，在花粉的附著吸水、花粉與柱頭的相互識別過程中起重要作用[9]。本試驗(yàn)觀察顯示，大豆柱頭表面的近圓形乳突上有一層蛋白質(zhì)表膜；但是大豆柱頭與花柱之間的棒狀乳突并未被表膜覆蓋，其上分泌物也較少，在處理樣品過程中棒狀乳突極易失水而變得干癟。授粉時(shí)花粉一般不落到棒狀乳突上，這說明棒狀乳突并不參與花粉與柱頭的相互識別過程，只有柱頭表面的近圓形乳突參與這一識別過程。在觀察不同時(shí)期的柱頭表面時(shí)發(fā)現(xiàn)，柱頭表面的近圓形乳突比棒狀乳突發(fā)育較早。柱頭上的表膜很薄，極易破碎，在花粉落到表膜上時(shí)，表膜易被分泌物所分解。通過觀察大豆不同時(shí)期的柱頭，發(fā)現(xiàn)分泌物隨著柱頭的不斷成熟而增多，當(dāng)花粉落到柱頭上時(shí)，柱頭乳突細(xì)胞會分泌大量滲出物，能夠激活花粉并使花粉管持續(xù)增長。但還有較大比例的花粉管在花柱內(nèi)生長過程中萎縮，并沒有到達(dá)子房。根據(jù)前人研究結(jié)果[10]，試驗(yàn)認(rèn)為大豆中的這種現(xiàn)象也是自然選擇結(jié)果，即花粉管增長速度和配子體遺傳優(yōu)勢的競爭，能夠調(diào)控其個(gè)體生長和影響受精。

大豆柱頭表面細(xì)胞壁之間有胞間連絲，表明柱頭細(xì)胞具有傳遞細(xì)胞的特征。傳遞細(xì)胞在生殖器官中分布廣泛[11]，其主要功能為：向周圍環(huán)境或組織分泌物質(zhì)，或者從周圍環(huán)境或組織吸收物質(zhì)[12]。大豆柱頭細(xì)胞的傳遞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，可能有利于柱頭細(xì)胞之間傳遞物質(zhì)，并有利于柱頭細(xì)胞向柱頭表膜分泌參與花粉與柱頭相互識別作用的物質(zhì)。

柱頭細(xì)胞和花柱細(xì)胞的液泡內(nèi)有豐富的貯藏蛋白質(zhì)，這些組織細(xì)胞內(nèi)也含有豐富的多糖類物質(zhì)，這些蛋白質(zhì)及多糖類物質(zhì)可能用于合成柱頭分泌物，以及為花粉管在花柱中的生長提供營養(yǎng)。

大豆花柱中的通道細(xì)胞具有分泌功能，向著花柱道一面的細(xì)胞壁有十分顯著的內(nèi)突，質(zhì)膜沿內(nèi)突表面分布，增加細(xì)胞的表面積；通道細(xì)胞也具有傳遞細(xì)胞的功能，可以迅速地從周圍細(xì)胞中吸收溶質(zhì)并轉(zhuǎn)運(yùn)到花柱道中?；ㄖ幕窘M織細(xì)胞，特別是靠近通道細(xì)胞的薄壁細(xì)胞代謝活躍，并且含有豐富的淀粉粒，這些淀粉粒是營養(yǎng)物質(zhì)的部分來源[13]，而營養(yǎng)物分泌到細(xì)胞壁，并通過細(xì)胞壁上的胞間連絲向內(nèi)運(yùn)輸，因而營養(yǎng)物在這些薄壁細(xì)胞的壁中由外向內(nèi)形成一個(gè)梯度，最后由通道細(xì)胞內(nèi)表面的壁釋放到花柱道中，為萌發(fā)的花粉管提供營養(yǎng)。而且在開花期間，將粘性物質(zhì)釋放在花柱道的表面上，花粉管沿著花柱道的表面分泌液生長，直至到達(dá)子房。

[1]中國科學(xué)院植物研究所.中國高等植物圖鑒[M].北京:科學(xué)出版社,1979.

[2]苗興芬.多年多點(diǎn)條件下大豆脂肪酸含量QTL分析[D].哈爾濱:東北農(nóng)業(yè)大學(xué),2010:1-2.

[3]肖丹娜.中國大豆貿(mào)易地位及國際競爭力的研究[D].天津:天津財(cái)經(jīng)大學(xué),2010:9-10.

[4]Graa B H J,Derksen J W M,Mariani C.Pollen and pistil in the progamic phase[J].Sex Plant Reprod,2001,14:41-45.

[5]閆守偉,張素麗,張國軍,等.不同葡萄品種柱頭、花柱發(fā)育與種子形成的關(guān)系[J].西北植物學(xué)報(bào),2007,27(3):435-441.

[6]劉寧.花柱和柱頭的結(jié)構(gòu)[J].植物學(xué)通報(bào),1998,33(4):15-17.

[7]Anna F E,Rober S,Daphne P.Pollen and stigma structure and function:The role of diversity in pollination[J].Plant Cell,2004,16:84-97.

[8]胡適宜,徐麗云.顯示環(huán)氧樹脂厚切片中多糖蛋白質(zhì)和脂類的細(xì)胞化學(xué)方法[J].植物學(xué)報(bào),1990,32(11):841-846.

[9]孟金陵.植物生殖遺傳學(xué)[M].北京:科學(xué)出版社,1995:50-53.

[10]Ottaviano E,Sari-Gorla M,Mulcahy D L.Pollen tube growth rates in Zea mays:Implications forgenetic improvement of crops[J].Science,1980,210:437-438.

[11]Folson M W,Cass D D.Changes in transfer cell distribution in the ovule of soybean after fertilization[J].Can J Bot,1986,64:965-972.

[12]李正理,張新英.植物解剖學(xué)[M].北京:高等教育出版社,1983:76-96.

[13]王艷杰,劉林德,孔冬瑞,等.刺五加雌、雄花的花柱引導(dǎo)組織結(jié)構(gòu)觀察[J].電子顯微學(xué)報(bào),2011,30(4/5):460-465.