■李鐵梁 羅 琳馬志宏邢 薇姜 娜夏 磊

（1.北京市水產(chǎn)科學研究所，北京 100068；2.北京鑫洋水產(chǎn)高新技術有限公司，北京 102488）

中草藥是中國醫(yī)藥中的瑰寶，其毒副作用小、不易造成環(huán)境污染，而且含有多種免疫調(diào)節(jié)成分，如生物堿、多糖、皂甙、揮發(fā)油、有機酸等[1]。中草藥作為抗菌藥、生長促進劑、免疫調(diào)節(jié)劑已經(jīng)在養(yǎng)殖業(yè)中得到了廣泛的應用[2-3]。利用現(xiàn)代超微粉碎技術加工中草藥，可以提高植物細胞破壁率，從而提高其成分溶出率、生物利用率，更好地改善中草藥劑型、藥效[4-5]。本實驗采用獸用國標中草藥三黃粉和肝膽利康散，以錦鯉為實驗動物，研究、對比超微粉碎技術加工的中草藥與普通粉碎中草藥的作用效果，以期通過本實驗為天然物中草藥的制備工藝提供一些新的思路與參考。

1 材料和方法

1.1 實驗用錦鯉

本實驗錦鯉購自北京金竹園錦鯉養(yǎng)殖場，選取體質(zhì)健康、規(guī)格相近的紅白種錦鯉為實驗用魚，平均體長為13.5 cm，平均體重為55.6 g。

1.2 實驗飼料

實驗基礎飼料選用市售錦鯉飼料。

1.3 實驗用中草藥

實驗用中草藥為市售三黃粉、肝膽利康散（80目）成品及超微粉碎的三黃粉、肝膽利康散（300目）[4]、獸用藥物氟苯尼考，以上藥物均由北京鑫洋水產(chǎn)高新技術有限公司提供，藥品符合國家獸藥標準要求。

1.4 主要試劑及儀器

超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）測定試劑盒均購自南京建成科技有限公司；血清總蛋白（TP）試劑盒（批號：03183743190）、血清白蛋白（ALB）試劑盒（批號：03183688122）均由德國診斷有限公司生產(chǎn)；NBT（Nitrotetrazolium Blue Chloride）試劑購自Amresco，三氯叔丁醇購自國藥集團化學試劑有限公司；全自動生化儀為ROCHE COBAS/C501型，全波段酶標儀為Biotek ECO型；超微粉碎機為青島海納威微粉工程有限公司生產(chǎn)的HZM-200型。

1.5 攻毒實驗所用菌株為中國普通微生物菌種保藏管理中心提供的錦鯉潰瘍病致病菌維氏氣單胞菌(Aeromonas Veronii)[6]，菌株編號：CGMCC No.7231。

1.6 實驗方法

1.6.1 三黃粉預防性實驗

以投喂不添加藥物的基礎料的錦鯉為陰性對照組；以投喂添加0.2%氟苯尼考的料的錦鯉為陽性對照組；以分別添加1%普通三黃粉和1%超微粉三黃粉料的錦鯉為兩個實驗組，每組設3個重復，每個重復12尾魚。陰性對照組自始至終投喂基礎料；陽性對照組和實驗組在投喂連續(xù)7 d實驗料后連續(xù)投喂7 d陰性對照料，接著再連續(xù)投喂7 d實驗料。投喂實驗結(jié)束后使用錦鯉潰瘍病致病性維氏氣單胞菌（Aeromonas Veronii）攻毒實驗錦鯉。通過預實驗確定對實驗錦鯉的半致死濃度數(shù)量級為106cfu/ml，實際攻毒濃度為8.8×106cfu/ml，采取背部肌肉注射，注射劑量為0.3 ml/尾，實驗組、對照組均注射，攻毒后各組均投喂普通基礎料；觀察兩周記錄各組的發(fā)病魚數(shù)量、死亡數(shù)量及死亡時間，實驗結(jié)束后統(tǒng)計發(fā)病率和死亡率。

1.6.2 肝膽利康散實驗

以不添加藥物的基礎料為對照組，分別添加0.2%普通粉碎和超微粉肝膽利康散的飼料為實驗組，每組均設3個重復，每個重復10尾魚。持續(xù)投喂3周后，將各組魚用0.5‰三氯叔丁醇麻醉后，稱體重，尾靜脈取血，置于肝素抗凝管中；取100 μl全血用于NBT的檢測；剩下的抗凝血于4℃條件下3 000 r/min離心10 min，收集上清液于-80℃保存，用于測定超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、血清總蛋白（TP）和血清白蛋白（ALB）。

1.7 飼養(yǎng)管理

各個養(yǎng)殖桶分別投喂相應飼料，每天投喂3次，分別為9:00、13:00和17:00，按體重的2%～3%飽食投喂；注意觀察魚的攝食情況并詳細記錄，另外，詳細記錄發(fā)病魚、死亡魚的數(shù)量及死亡時間，并對死魚進行稱重、記錄，溶氧保持在5 g/min以上，水溫不低于20℃。

1.8 指標檢測方法

1.8.1 NBT檢測：取錦鯉靜脈血與0.2%NBT溶液等體積混合，室溫孵育30 min；取45 μl混合液到900 μl N,N-二甲基酰胺中，充分混勻；常溫，2 000 r/min離心5 min；設3個重復，每個重復取200 μl離心上清液到石英酶標板中，540 nm下比色讀取OD值。

1.8.2 超氧化物歧化酶（SOD）、堿性磷酸酶（AKP）、谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）、血清總蛋白（TP）、血清白蛋白（ALB）檢測均按相關試劑盒使用說明中的方法操作。

1.8.3 計算公式

發(fā)病率(%)=有典型癥狀的魚/實驗組魚的數(shù)量×100。

平均發(fā)病率（%）=實驗組發(fā)病率之和/實驗組重復數(shù)×100。

死亡率（%）=死亡魚的數(shù)量/實驗組魚的數(shù)量×100。

平均死亡率（%）=實驗組死亡率之和/實驗組重復數(shù)。

血清球蛋白=血清總蛋白（TP）-血清白蛋白（ALB）。

血清白球比=血清白蛋白值/血清球蛋白值。1.8.4 統(tǒng)計方法

本實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析在STATISTICA 7.0環(huán)境下進行。實驗結(jié)果用“平均數(shù)±標準差”表示，對數(shù)據(jù)進行單因素方差分析（ANOVA），并結(jié)合Duncan's法進行多重比較，P＜0.05表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 三黃粉實驗結(jié)果

攻毒后第2 d，部分錦鯉即出現(xiàn)了典型的潰瘍病癥狀：體表注射部位隆起；隨著病癥的發(fā)展，注射部位出現(xiàn)紅腫、鱗片脫落的癥狀，部分錦鯉體表潰爛、肌肉外露[6]，重癥時，實驗魚停止進食，開始出現(xiàn)死亡。從表1可以看出，三黃超微粉組對錦鯉潰瘍病有著明顯的預防保護作用，其效果要顯著優(yōu)于添加普通三黃粉的實驗組以及添加氟苯尼考的陽性對照組（P＜0.05）；實驗中對病魚癥狀的實時觀察也顯示，三黃超微粉組魚的發(fā)病癥狀要比其它各組輕，實驗結(jié)束時，部分出現(xiàn)癥狀的實驗魚已經(jīng)痊愈；而添加了普通三黃粉的實驗組對該病的預防作用與陽性、陰性對照組則無顯著差異（P＞0.05）。

表1 攻毒實驗中錦鯉發(fā)病率統(tǒng)計

表2結(jié)果顯示，攻毒實驗的第3 d，陰性對照組和普通三黃粉組的錦鯉開始出現(xiàn)死亡，陽性對照組在第5 d開始出現(xiàn)死亡，而添加超微粉三黃粉實驗組在第10 d才出現(xiàn)死魚，且只有其中一個重復死了2尾，其余兩個重復從始至終均無死魚出現(xiàn)。統(tǒng)計結(jié)果也顯示，超微粉組的死亡率要顯著低于其余各組（P＜0.05）；而添加普通三黃粉的實驗組死亡率與陽性、陰性對照組則無顯著差異（P＞0.05）。

表2 攻毒實驗中錦鯉死亡率統(tǒng)計

2.2 肝膽利康散實驗結(jié)果（見表3）

表3結(jié)果顯示，添加肝膽利康散的兩個實驗組的NBT值要顯著低于對照組（P＜0.05），兩個實驗組之間無顯著差異（P＞0.05）；3個實驗組間的谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）無顯著差異（P＞0.05）；普通粉組的谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）顯著高于其余兩組（P＜0.05）；超微粉實驗組與普通粉實驗組超氧化物歧化酶（SOD）無顯著差異，但均顯著高于對照組（P＜0.05）；3組的堿性磷酸酶（AKP）水平均無顯著差異（P＞0.05）。

表3 肝膽利康散實驗數(shù)據(jù)統(tǒng)計結(jié)果

表4所顯示的的是所測錦鯉肝功能的指標。結(jié)果顯示，普通粉組的血清球蛋白（GLOB）明顯高于對照組（P＜0.05），而兩個實驗組間差異不顯著，超微粉實驗組與對照組之間也無顯著差異（P＞0.05）；其它指標各組間均無顯著差異（P＞0.05）。

表4 投喂肝膽利康散后錦鯉肝功能指標檢測結(jié)果

3 討論

中草藥的重要藥效成分通常分布于細胞內(nèi)與細胞間質(zhì)，且以細胞內(nèi)為主[7]。植物細胞壁內(nèi)填充和附加有木質(zhì)素，因此，細胞壁和細胞群壁具有較強的韌性。普通粉碎的藥材粉末，細胞破壁率低，當藥物進入動物體內(nèi)后藥粉的粉粒吸水膨脹，有效成分通過擴散不斷地從細胞壁和細胞膜釋放出來，擴散需要細胞內(nèi)外具有濃度差，當胞內(nèi)外濃度差很小或平衡時，有效成分的釋放速度將非常緩慢，甚至停止，位于內(nèi)部細胞中的有效成分有時還來不及釋放就被排出體外，因而常常達不到有效的治療濃度。經(jīng)過超微粉碎后的中草藥，植物細胞破壁率高，有效成分在沒進入機體前就暴露出來，進入體內(nèi)后可溶性成分迅速溶解，即使溶解度低的成分也因超微粉具有較強的附著力而緊緊黏附在胃腸內(nèi)壁的黏膜上，使在胃腸道停留時間延長、吸收更充分，吸收量也會增加，由于細胞壁大部分在粉碎時被破壞，有效成分則不需通過細胞壁和細胞膜的釋放過程，這樣從藥物的釋放速度和釋放量上超微粉碎中草藥要遠優(yōu)于普通粉碎中草藥[4]。

三黃粉由黃芩、黃柏、大黃、大青葉按比例配伍而成，其中黃芩、大黃主要成分為黃芩甙元、大黃酚、鞣酸，具有廣譜抗菌、抗炎抗變態(tài)等作用，黃柏含有的小檗堿成分能夠抑制細菌的呼吸和細菌核糖核酸的合成[8]。迄今為止，三黃粉作為國標獸藥已經(jīng)被廣泛應用于魚類病害防治中，主要用來防治水產(chǎn)動物細菌性疾病[9]。史國富等（2011）[10]證明了超微粉黃芩中的黃芩苷溶出度要大幅高于普通粉黃芩。通過本實驗結(jié)果還可以看出，投喂超微粉三黃粉的實驗魚發(fā)病率、死亡率都顯著低于其它實驗組（P＜0.05），這充分說明超微粉碎技術大幅提高了三黃粉中中草藥的破壁率，使其有效成分得到了充分的釋放，而實驗魚對有效成分的吸收利用也較充分，因此實驗魚對超微粉三黃粉的利用率要高于普通粉碎三黃粉，從而成功保護了實驗魚免受攻毒細菌的侵襲。所以利用超微粉碎技術加工三黃粉能夠大幅提高藥效。

在魚類的血細胞中，單核細胞、巨噬細胞和各種粒細胞具有吞噬異物的能力[11]，這些吞噬細胞吞噬異物后，產(chǎn)生大量氧自由基，能量消耗劇增，耗氧量隨之相應增加，稱為呼吸爆發(fā)。呼吸爆發(fā)是魚類非特異性細胞反應的主要指標之一，可直接反映出魚類非特異性免疫能力的大小，而NBT值是直接反映吞噬細胞吞噬活性的一個指標，與魚體非特異性免疫功能成正相關關系[12]。本研究結(jié)果卻顯示，隨著投喂時間的延長，投喂肝膽利康散的兩個實驗組的NBT值均顯著低于對照組（P＜0.05）。肝膽利康散的主要成分為茵陳，茵陳中起作用的是一些有機酸和揮發(fā)油，如茵陳二炔、茵陳二炔酮和茵陳炔內(nèi)酯、醇提取物等揮發(fā)油具有促進膽汁分泌和排泄作用，而茵陳香豆酸A和茵陳香豆酸B等有機酸具有利膽作用，因此茵陳具有促進膽汁分泌、保肝、助消化的作用[8]，主要用于預防魚類因消化不良引起的肝膽綜合癥[13]。這些有效成分的作用促進了胃酸和膽汁的分泌，從而改變了消化道內(nèi)的pH值[14]，而腸道pH值的變化又有可能導致了肝臟的免疫偏差和免疫活性抑制[15]，所以NBT活性的降低可能是這種免疫活性抑制的表現(xiàn)之一。

氧自由基是機體內(nèi)化學性質(zhì)很活躍且毒性很強的一類物質(zhì)，能夠攻擊細胞膜上的脂肪酸產(chǎn)生過氧化物，這些物質(zhì)是毒性很強的一種物質(zhì)，它會侵害體內(nèi)的核酸、蛋白質(zhì)等而引起一系列的細胞破壞作用。而超氧化物歧化酶(SOD)是存在于機體正常組織當中的清除氧自由基的重要酶系統(tǒng)，其活力的高低間接反映了機體清除氧自由基的能力，SOD活性越強，說明機體清除氧自由基的能力越強[16]。本研究結(jié)果顯示，添加肝膽利康散的兩個實驗組SOD活力水平都顯著高于對照組(P＜0.05)，說明該中草藥對提高魚體SOD酶活性，消除氧自由基作用明顯。

谷丙轉(zhuǎn)氨酶（GPT）和谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）是廣泛存在于魚類細胞漿和線粒體中的重要氨基酸轉(zhuǎn)氨酶，在魚體蛋白質(zhì)代謝過程中起重要作用，是指示肝細胞功能的敏感指標[17-18]。血清總蛋白（TP）、血清球蛋白（GLOB）、血清白蛋白（ALB）以及血清白球比（A/G）等指標在臨床上也是肝臟是否病變的必檢指標，常和GPT和GOT的活性變化衡量肝臟受損傷的程度[19]。堿性磷酸酶（AKP）是磷代謝過程中的重要酶類，在營養(yǎng)物質(zhì)的消化、吸收和運轉(zhuǎn)過程中起重要作用，也是動物體內(nèi)重要的解毒體系，血清中的堿性磷酸酶主要來源于肝臟和骨骼，在一定范圍內(nèi)AKP含量高說明機體的解毒功能較強，也說明肝臟的功能較強[20]。本研究的結(jié)果除普通粉實驗組的谷草轉(zhuǎn)氨酶（GOT）和球蛋白（GLOB）顯著高于對照組外，其余指標之間均無顯著差異。肝膽利康散對實驗魚的肝臟及消化指標未能表現(xiàn)出明顯的改善作用，也沒顯示出超微粉的優(yōu)勢，這可能是由于肝膽利康散的主要作用是促進膽汁分泌、提高魚體對飼料中營養(yǎng)成分利用率的作用，從而減輕魚體肝臟的負擔，降低魚類患肝臟疾病的風險，在養(yǎng)殖實踐中肝膽利康散主要用于改善患肝膽綜合癥的魚體的體質(zhì)[21]；而我們所用的實驗魚均為無肝臟病變的健康魚，所以體現(xiàn)不出藥物對肝臟不正常指標有改善作用，進而也體現(xiàn)不出超微粉肝膽利康散的效果優(yōu)勢。另外據(jù)報道，運用超微粉碎技術加工含揮發(fā)油成分的中草藥會使揮發(fā)油流失[22]，肝膽利康散配方中，主劑茵陳主要起作用的成分就是揮發(fā)油，所以，超微粉肝膽利康散中揮發(fā)油成分的損失也可能是造成其藥效不顯著的原因之一。

4 結(jié)語

綜上所述，采用超微粉碎技術加工兩種不同的中草藥，在錦鯉上的作用效果明顯不同，對以鞣質(zhì)為主要有效成分的三黃粉明顯提高了其藥效，但對以揮發(fā)油為有效成分的肝膽利康散的增效作用則不明顯。根據(jù)對研究結(jié)果的分析，利用超微粉碎技術對中草藥的增效作用不能一概而論。經(jīng)超微粉碎后，中草藥揮發(fā)性成分的流失率，不同種類中草藥最佳粒徑的選擇，破壁后大分子有機成分有無被破壞，以及由于藥物成分溶出率的改變，中草藥原組方配伍比例是否需要調(diào)整等問題都尚需更深入的研究。