■齊利枝 閆素梅 生 冉 趙艷麗 金 鹿

(內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，內(nèi)蒙古呼和浩特 010018)

乳腺中約50%的脂肪酸來源于乙酸等乳脂前體物在乳腺內(nèi)的從頭合成，主要包括中短鏈脂肪酸（C4∶0～C14∶0）及50%的C16∶0；長鏈脂肪酸（C18∶0及50%的C16∶0）除油酸是乳腺中由硬脂酸通過△9-去飽和酶系統(tǒng)產(chǎn)生外，其余均來自日糧[1]。乳脂是最容易受到遺傳、生理和日糧等因素影響而發(fā)生改變的乳成分。研究已經(jīng)證實(shí)乙酸等用于從頭合成的乳脂前體物與外源供給的長鏈脂肪酸（LCFA）對(duì)乳脂肪的合成有直接的影響，日糧中增加LCFA的供給對(duì)脂肪酸的從頭合成有顯著的抑制作用，增加中、短鏈脂肪酸（SMCFA）的供給可以減少用于從頭合成的短鏈脂肪酸（SCFA），可提高乳脂含量，改變其脂肪酸組成[2]。因此，深入探討乳脂前體物對(duì)乳脂肪合成的影響機(jī)理對(duì)不斷改善乳脂組成及乳品質(zhì)有重要意義。乙酸作為奶牛乳腺脂肪酸內(nèi)源合成的主要前體物，體外研究結(jié)果表明，其可以促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞甘油三酯（TAG）合成?？讘c洋等[3]研究了不同濃度的乙酸鈉對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞胞外TAG濃度的影響，結(jié)果表明，隨著乙酸添加劑量的增加，TAG濃度顯著增加。Maxin等（2011）[4]的研究表明，瘤胃灌注乙酸處理組乳脂率增加了6.5%，而且改變了乳脂組成。提示乙酸對(duì)乳脂合成有一定的影響，但其機(jī)制仍然不清楚。分化抗原簇36（CD36）參與乳脂分泌，但其更重要的作用是轉(zhuǎn)運(yùn)脂肪酸進(jìn)入奶牛乳腺細(xì)胞(Bionaz等，2008a)[5]。脂肪酸結(jié)合蛋白3（FABP3）參與細(xì)胞內(nèi)脂肪酸的轉(zhuǎn)運(yùn)，并且在泌乳期奶牛乳腺中的FABP3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量上調(diào)(Bionaz和Loor，2008b)[6]。因此，乙酸對(duì)乳脂肪合成的影響可能與CD36和FABP3 mRNA的基因表達(dá)有關(guān)，而關(guān)于這方面的研究較少。本試驗(yàn)主要研究乙酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力及CD36和FABP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響，為進(jìn)一步研究乙酸對(duì)乳脂肪合成的影響提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

DMEM/FA12培養(yǎng)基(Gibco，美國)、胎牛血清（FBS，Gibco，美國）、無脂肪酸牛血清白蛋白(BSA，Equitech-Bio，美國）、催乳素(Gibco，美國)、表皮生長因子(Gibco，美國)、胰蛋白酶(Gibco，美國)、胰島素轉(zhuǎn)鐵蛋白(Gibco，美國)、雙抗(Gibco，美國)、乙二胺四乙酸（EDTA，Gibco，美國）、氫化可的松（Sig?ma，美國）、噻唑藍(lán)（MTT，Sigma，美國）、二甲基亞砜(DMSO，Sigma，美國)、乙酸鈉（Sigma，美國）、RNAprep pure Cell/Bacteria Kit（TIANGEN，北京）、PrimeScript RT Master Mix(TaKaRa，大連)和 SYBR Premix Ex TaqTMⅡ(TaKaRa，大連)。實(shí)時(shí)定量PCR儀（Roche，瑞士）、酶標(biāo)儀（Biotek，美國）、倒置顯微鏡（Olympuse，日本）。

1.2 乳腺上皮細(xì)胞的培養(yǎng)

采用膠原酶消化法獲得乳腺上皮細(xì)胞。選取健康的荷斯坦奶牛，取其乳腺組織，去除組織外層，剪取若干約1 cm3的組織塊，置于預(yù)冷的PBS溶液中。在無菌超凈臺(tái)中將組織塊用PBS洗凈后，去除組織塊表層將其剪成糊狀。加入0.5%膠原酶Ⅱ溶液，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中消化1 h，每20 min輕搖離心管。然后用孔徑80目的細(xì)胞濾網(wǎng)進(jìn)行過濾，收集細(xì)胞濾液，1 500 r/min離心5 min，棄掉上清液，加入含有10%FBS的DMEM/F12細(xì)胞培養(yǎng)液，用移液槍吹打均勻，接種在25 cm2培養(yǎng)瓶中，置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞的融合度為80%～90%時(shí)，用胰蛋白酶消化處理乳腺上皮細(xì)胞并進(jìn)行傳代。本試驗(yàn)采用第3代細(xì)胞。

1.3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

將傳第3代的乳腺上皮細(xì)胞懸液接種于細(xì)胞培養(yǎng)板上，每孔加入含10%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液，于 37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)48 h的奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)孔隨機(jī)分為1個(gè)對(duì)照組和5個(gè)試驗(yàn)組。每組分別加入含0、4、6、8、10、12 mmol/l乙酸（以乙酸鈉的形式添加）的DMEM/F12培養(yǎng)液，并用1 g/l無脂肪酸的BSA替代培養(yǎng)液中的FBS，其中0 mmol/l為對(duì)照組。置于37℃和5%CO2的培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)48 h。

1.4 測(cè)試指標(biāo)與方法

1.4.1 細(xì)胞活力

細(xì)胞活力的檢測(cè)采用MTT法，以細(xì)胞相對(duì)增殖率（Relative Growth Rate,RGR）表示。在細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)束前4 h，每孔加入20 μl MTT（5 mg/ml）；4 h后棄上清液，每孔加入100 μl DMSO，振蕩10 min后，用全自動(dòng)酶標(biāo)儀（Synergy H4 Reader）在490 nm波長下檢測(cè)各培養(yǎng)孔的吸光值（OD490）。RGR=（試驗(yàn)組OD490/對(duì)照組OD490）×100%。每個(gè)處理4個(gè)重復(fù)。

1.4.2 乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)FABP3和CD36 mRNA的表達(dá)

乳腺上皮細(xì)胞內(nèi)FABP3和CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)量采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)。將每孔1×105細(xì)胞懸浮液接種于6孔培養(yǎng)板,培養(yǎng)48 h，在每孔加入含有不同濃度乙酸的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中繼續(xù)培養(yǎng)48 h后，提取RNA。細(xì)胞RNA的提取、反轉(zhuǎn)錄和熒光定量PCR分別采用RNAprep pure Cell/Bacteria Kit試劑盒、PrimeScript?RT reagent Kit和SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒進(jìn)行操作。選用管家基因磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參基因，引物見表1。實(shí)時(shí)熒光定量PCR的反應(yīng)程序?yàn)椋?5.0 ℃、30 s；95.0 ℃、30 s，Tm 30 s，72.0 ℃20 s，40cycles；72 ℃、7 min；溶解曲線程序?yàn)椋?0～95℃，每6 s升高0.5℃,51cycles。每個(gè)處理組6個(gè)重復(fù)。采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)定量數(shù)據(jù)分析[7]。

表1 Primer sequence

1.5 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SAS（SAS 9.0）軟件的回歸統(tǒng)計(jì)程序進(jìn)行，對(duì)不同濃度的乙酸處理效應(yīng)進(jìn)行一次線性和二次曲線回歸分析，P＜0.05表示差異顯著，

0.05＜P＜0.10表示差異趨于顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加乙酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的影響（見表2）

表2 乙酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的影響

如表2所示，4～10 mmol/l的所有乙酸處理組RGR均高于對(duì)照組，其中，以4～8 mmol/l乙酸處理組較高。當(dāng)乙酸濃度增加到12 mmol/l時(shí)，RGR降低，并低于對(duì)照組?；貧w分析結(jié)果表明，隨著乙酸濃度的增加RGR呈二次曲線增加，二者呈顯著的劑量依賴關(guān)系(P=0.005)，回歸方程為y=-0.006 85x2+0.071 15x+1.000 48，R2=0.970 6；其中x為乙酸添加水平，y為RGR。這些結(jié)果提示低濃度的乙酸可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力，而高濃度則表現(xiàn)出抑制作用。

2.2 添加乙酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞FABP3和CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響（見表3）

表3 乙酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞CD36和FABP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量的影響

從表3可以看出，添加不同濃度的乙酸均下調(diào)了CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)量，且以8～12 mmol/l乙酸組CD36的表達(dá)量較低。FABP3表達(dá)量的結(jié)果正好相反，即4～12 mmol/l的所有乙酸處理組FABP3基因表達(dá)量均不同程度高于對(duì)照組，其中以10～12 mmol/l乙酸組表達(dá)量較高。從回歸統(tǒng)計(jì)結(jié)果看，CD36的相對(duì)表達(dá)量隨著乙酸添加濃度的增加呈顯著的一次線性（P=0.011）和二次曲線（P=0.000）降低，回歸方程為:y=-0.038 59x+0.903 89，R2=0.831 0；y=0.004 55x2-0.093 14x+1.122 93，R2=0.994 82；其中x為乙酸添加水平，y為CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)量。隨著乙酸添加濃度的增加，F(xiàn)ABP3的表達(dá)量呈顯著的一次線性(P=0.001)和二次曲線(P=0.010)增加，回歸方程為:y=0.247 44x+0.98 84，R2=0.945 0；y=0.006 75x2+0.166 38x+1.122 93，R2=0.955 2；其中X為乙酸添加水平，y為FABP3 mRNA相對(duì)表達(dá)量。說明乙酸的添加可下調(diào)CD36的基因表達(dá)量，上調(diào)FABP3表達(dá)量。

3 討論

細(xì)胞活力是用來反映細(xì)胞存活和增殖的指標(biāo)。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，乙酸作為脂肪酸內(nèi)源合成的主要前體物和主要能源物質(zhì)，對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力有一定的調(diào)節(jié)作用，二者呈劑量依賴關(guān)系，低濃度的乙酸可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力，而高濃度則表現(xiàn)出抑制作用。目前關(guān)于乙酸對(duì)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力的研究尚未見報(bào)道，其機(jī)理還需要進(jìn)一步探討。

FABP和CD36是奶牛乳腺中兩種主要的LCFA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，在牛乳腺中FABP和CD36的共表達(dá)提示這兩種蛋白存在相近的功能關(guān)系(Spitsberg等,1995)[10]。在奶牛乳腺組織中FABP3、FABP4和FABP5三種異構(gòu)體的mRNA表達(dá)量較高，在泌乳階段FABP3 mRNA表達(dá)量最高(Bionaz和Loor,2008b)[6]。FABP3參與細(xì)胞內(nèi)LCFA的轉(zhuǎn)運(yùn)，CD36主要將脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入乳腺細(xì)胞，二者與乳腺上皮細(xì)胞對(duì)長鏈脂肪酸的攝取與轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)。然而，目前關(guān)于乙酸對(duì)FABP3和CD36基因表達(dá)的研究極少。Yonezawa等（2004）在奶牛乳腺上皮細(xì)胞培養(yǎng)液中分別添加10 mmol/l乙酸、丁酸或辛酸，研究結(jié)果表明，辛酸顯著上調(diào)了細(xì)胞中CD36 mRNA表達(dá)量，但乙酸和丁酸對(duì)CD36表達(dá)量的促進(jìn)作用遠(yuǎn)低于辛酸，并提示乙酸、丁酸或辛酸CD36表達(dá)量的上調(diào)作用似乎與碳原子的數(shù)量有關(guān)[11]。Storry等（1965）[12]體內(nèi)試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，瘤胃灌注乙酸增加了乳脂中C4-C16脂肪酸的量，而降低了所有C18脂肪酸的量。崔海（2011）[2]的研究結(jié)果也表明，在奶牛日糧中添加SMCFA，乳脂中C10∶0、C12∶0、C14∶0、C14∶1、C16∶0和C14∶1含量增加，除了c9-C18∶1外其它C18脂肪酸含量均增加。這些結(jié)果提示，外源補(bǔ)充乙酸鈉降低了乳脂中長鏈脂肪酸的量，即降低了乳脂中來源于外源供給的LCFA的比例。本試驗(yàn)的研究結(jié)果表明，不同濃度的乙酸處理組均下調(diào)了CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)量。這一結(jié)果可能解釋了外源補(bǔ)充乙酸鈉是通過下調(diào)脂肪酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CD36 mRNA表達(dá)量，影響乳腺上皮細(xì)胞對(duì)LCFA的攝取進(jìn)而引起乳脂中LCFA的合成受限。然而，本試驗(yàn)的結(jié)果也表明，F(xiàn)ABP3的mRNA表達(dá)量隨著乙酸添加濃度的增加而增加，與CD36的表達(dá)量結(jié)果相反。FABP3和CD36盡管都是LCFA的轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，但前者主要與細(xì)胞內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)，后者與細(xì)胞的攝取有關(guān)，其功能并不相同，因此乙酸鈉對(duì)這兩種轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因表達(dá)量的調(diào)節(jié)作用并不矛盾。目前關(guān)于該領(lǐng)域的研究甚少，還需要進(jìn)一步探討。

4 結(jié)論

①乳腺上皮細(xì)胞活力與乙酸濃度呈顯著的二次劑量依賴關(guān)系，低濃度的乙酸可促進(jìn)奶牛乳腺上皮細(xì)胞活力，而高濃度則表現(xiàn)出抑制作用。

②不同濃度的乙酸處理均下調(diào)了CD36 mRNA相對(duì)表達(dá)量，上調(diào)了FABP3 mRNA表達(dá)量。