■ 張春梅 苑志朋 易賢武 劉建新

(1.商丘師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河南商丘 476000；2.浙江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院動(dòng)物分子營(yíng)養(yǎng)學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江杭州 310029）

亞麻酸是一種多不飽和脂肪酸，在植物油中含量豐富，以亞麻籽油和蘇籽油中含量最高，可達(dá)50%以上。目前已有研究表明，反芻動(dòng)物日糧中添加亞麻酸或富含亞麻酸的植物油可以顯著降低溫室氣體甲烷的排放、改變瘤胃發(fā)酵模式[1-3]，且亞麻酸降低甲烷生成的效果與日糧類(lèi)型有關(guān)[4]。然而亞麻酸調(diào)控甲烷排放的同時(shí)，對(duì)瘤胃微生物區(qū)系有何影響尚未可知。

近年來(lái)，隨著分子生物技術(shù)的迅速發(fā)展，基于16S rDNA的分子生物學(xué)技術(shù)在胃腸道和環(huán)境微生態(tài)中被廣泛應(yīng)用，能對(duì)可培養(yǎng)和不可培養(yǎng)微生物群落進(jìn)行多樣性研究。基因指紋技術(shù)如變性梯度凝膠電泳（DGGE）能有效地分析瘤胃微生態(tài)系統(tǒng)的多樣性、監(jiān)測(cè)其種群的變化，可廣泛應(yīng)用于動(dòng)物、日糧和環(huán)境因素等對(duì)瘤胃微生物生態(tài)的影響，是一種快速而有效的方法。茅慧玲等[5]利用該技術(shù)研究了日糧中添加茶皂素和豆油對(duì)羔羊瘤胃細(xì)菌區(qū)系的影響。淡瑞芳等[6]用該技術(shù)對(duì)藏系綿羊瘤胃細(xì)菌區(qū)系的季節(jié)變化進(jìn)行了動(dòng)態(tài)分析。成艷芬等[7]則用該技術(shù)研究了厭氧真菌分離培養(yǎng)過(guò)程中共存的甲烷菌種類(lèi)及其多樣性。本試驗(yàn)旨在通過(guò)PCR-DGGE技術(shù)，研究飼喂不同精粗比日糧條件下添加亞麻酸的湖羊瘤胃細(xì)菌的多樣性及區(qū)系變化。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

試驗(yàn)用亞麻酸為乙酯型，購(gòu)自河南利諾生化有限責(zé)任公司，具體成分為：酯化的α-亞麻酸71.21%；亞油酸13.67%；油酸11.40%；硬脂酸3.53%；酸價(jià)：2.25 mg KOH/g；過(guò)氧化物值0.044%。

1.2 試驗(yàn)動(dòng)物及設(shè)計(jì)

8頭平均體重為（35±3.3）kg的成年健康湖羊（瘺管羊和非瘺管羊各4只），隨機(jī)分為4組，每組瘺管羊和非瘺管羊各一只，在整個(gè)試驗(yàn)期保持這種組合不變。4組湖羊按拉丁方設(shè)計(jì)分別飼喂4種日糧：高粗料日糧（F，精粗比為30∶70；不添加亞麻酸），高粗料添加亞麻酸日糧（FL，精粗比為25∶70；亞麻酸5%），高精料日糧（C，精粗比為70∶30；不添加亞麻酸）和高精料添加亞麻酸日糧（CL，精粗比為65∶30；亞麻酸5%），日糧的組成和營(yíng)養(yǎng)成分見(jiàn)表1。每頭羊每天分別飼喂1 kg基礎(chǔ)日糧，包括600 g苜蓿干草和400 g精料。整個(gè)試驗(yàn)期分別于8:30和16:30準(zhǔn)時(shí)喂料，自由飲水。

表1 日糧組成和營(yíng)養(yǎng)水平

1.3 瘤胃液采集及總DNA的提取

試驗(yàn)期結(jié)束后，取瘺管羊瘤胃液并迅速放入冰盒終止發(fā)酵，瘤胃液用四層紗布過(guò)濾，分裝后放入-80℃冰箱中保存。取解凍后混勻的瘤胃液樣品1 ml，采用珠磨法提取總DNA[8]。

1.4 PCR擴(kuò)增反應(yīng)

利用一對(duì)細(xì)菌通用引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rDNA V3區(qū)[9]，上游引物為：5’-CGC CCG CCG CGC GCG GCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GCC TAC GGG AGG CAG CAG，下游引物為：5’-ATT ACC GCG GCT GCT GG，由上海英駿公司代為合成。

PCR反應(yīng)體系為50 μl，采用降落PCR，反應(yīng)條件為：①94℃預(yù)變性 5 min；②94℃變性30 s，65℃退火1 min，72℃延伸 1 min，每?jī)蓚€(gè)循環(huán)退火溫度降低1℃，共20個(gè)循環(huán)；③94℃變性30 s，55℃退火1 min，72℃延伸 1 min，共10個(gè)循環(huán)；④72℃、10 min，最后4℃保溫。PCR反應(yīng)結(jié)束后取5 μl的PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR產(chǎn)物。

1.5 DGGE圖譜及分析

參照茅慧玲等[5]的方法，對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DG?GE分析。采用8%的丙烯酰胺凝膠，變性梯度(甲酰胺和尿素)為38%～53%，電泳條件為：電泳溫度為60℃，首先在200 V電壓下電泳10 min，隨后在100 V固定電壓下電泳15 h。電泳結(jié)束后，進(jìn)行硝酸銀染色，參照Sanguinetti等[10]的方法進(jìn)行。顯色定影后的凝膠用GS-800灰度掃描儀(Bio-Rad，USA)進(jìn)行掃描，Quantity One軟件(Bio-Rad，USA)對(duì)DGGE圖譜進(jìn)行相似性和多樣性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 瘤胃液細(xì)菌16S rDNA的PCR擴(kuò)增

飼喂不同日糧湖羊瘤胃液總細(xì)菌16S rDNA的V3區(qū)PCR產(chǎn)物的電泳圖譜見(jiàn)圖1，片斷大小在230 bp左右，與預(yù)期的大小一致。

圖1 瘤胃液總細(xì)菌V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖譜

2.2 瘤胃液細(xì)菌區(qū)系DGGE圖譜及多樣性分析

圖2顯示的是不同處理組瘤胃液總細(xì)菌區(qū)系16S rDNA的V3區(qū)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的DGGE譜帶。圖譜中有數(shù)十條譜帶，反映了瘤胃內(nèi)的優(yōu)勢(shì)細(xì)菌，泳帶的數(shù)量和復(fù)雜性說(shuō)明了瘤胃細(xì)菌的多樣性。大多數(shù)條帶在所有湖羊瘤胃液樣品的DGGE圖譜中存在，但高精料添加亞麻酸日糧明顯多出了一些條帶，見(jiàn)圖2中標(biāo)示。不同樣品DGGE圖譜的條帶數(shù)存在一定變化，在26至49條之間（見(jiàn)圖3）。統(tǒng)計(jì)分析顯示，高精料日糧添加亞麻酸的條帶數(shù)顯著升高，其余處理組之間差異不顯著。

2.3 瘤胃細(xì)菌區(qū)系的相似性分析

在不同日糧條件下飼喂亞麻酸湖羊的瘤胃液樣品DGGE圖譜的相似性見(jiàn)圖4。各處理瘤胃液樣品的微生物區(qū)系相似性指數(shù)處在43%～80%，個(gè)體差異比較大?？傮w上，16個(gè)處理的瘤胃液樣品形成兩個(gè)不同的簇，高精料日糧添加亞麻酸處理組單獨(dú)形成了簇Ⅰ，其余的處理組形成了簇Ⅱ。

圖2 亞麻酸在不同精粗比日糧下瘤胃液總細(xì)菌區(qū)系的DGGE圖譜

圖3 飼喂亞麻酸在不同精粗比日糧下湖羊瘤胃液的DGGE圖譜中條帶數(shù)

圖4 飼喂亞麻酸在不同精粗比日糧下湖羊瘤胃液的微生物區(qū)系之間的相似性分析

3 討論

瘤胃微生物非常復(fù)雜，且嚴(yán)格厭氧，由于缺乏獨(dú)特的選擇性培養(yǎng)基或用以判別細(xì)菌種類(lèi)的特異代謝終產(chǎn)物，使對(duì)瘤胃生態(tài)系統(tǒng)的研究困難重重。近年來(lái)，基于16S rRNA基因的分子生物學(xué)技術(shù)促進(jìn)了微生態(tài)研究的發(fā)展，特別是被稱(chēng)為DNA指紋技術(shù)的變性梯度凝膠電泳，能有效分析復(fù)雜微生物群落且無(wú)需培養(yǎng)，因而被廣泛用于動(dòng)物消化道菌群研究。茅慧玲等[5]利用PCR-DGGE技術(shù)研究日糧中添加茶皂素和豆油對(duì)羔羊瘤胃細(xì)菌區(qū)系的影響，DGGE圖譜顯示數(shù)十條清晰可辨的條帶，且不同的日糧有差異條帶存在，表明茶皂素和豆油的添加可選擇性的促進(jìn)或抑制一些菌的生長(zhǎng)。本試驗(yàn)對(duì)飼喂不同日糧精粗比條件下添加亞麻酸的湖羊瘤胃液樣品分析，檢測(cè)微生物區(qū)系的變化。從DGGE相似性指數(shù)看出，各個(gè)處理組最相似的為80%，相似性最低的僅為43%，說(shuō)明動(dòng)物間的個(gè)體差異比較大，做瘤胃微生物方面的分析必須考慮這些因素。高精料日糧和高粗料日糧并未分成明顯的兩個(gè)簇，而是混雜在一起，說(shuō)明改變?nèi)占Z類(lèi)型并未對(duì)瘤胃微生物區(qū)系產(chǎn)生大的影響。但高精料日糧添加亞麻酸顯著增加了瘤胃液樣品的DGGE條帶數(shù)，也即顯著增加了瘤胃微生物的多樣性，且四個(gè)重復(fù)自成一簇，形成了典型的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)，其原因和瘤胃微生物的具體種類(lèi)尚有待于進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

添加亞麻酸和日糧精粗比對(duì)瘤胃細(xì)菌區(qū)系有一定影響，高精料日糧添加亞麻酸的條帶數(shù)顯著升高，也即顯著增加了細(xì)菌的多樣性。各處理瘤胃液樣品的微生物區(qū)系相似性指數(shù)處在43%～80%，其中高精料日糧添加亞麻酸處理組四個(gè)重復(fù)自成一簇，形成了典型的微生物區(qū)系結(jié)構(gòu)。