■田亞紅 王巍杰 王之爽

(河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河北唐山 063000)

我國(guó)向日葵總產(chǎn)量在180～200萬(wàn)噸[1]，與此同時(shí)，產(chǎn)生大量的副產(chǎn)物向日葵花盤(pán)、秸稈等，其少部分直接用于禽畜飼料，但由于其粗纖維含量較高，動(dòng)物消化吸收率低，適口性差。如能有效地利用這些資源，將其轉(zhuǎn)化為可利用的生物蛋白飼料，不僅可以減少向日葵花盤(pán)、秸稈等廢棄物對(duì)環(huán)境的污染，而且能提高飼料的適口性、消化率和利用率，降低飼料成本，具有重要的研究意義。

本文探索了向日葵花盤(pán)、秸稈微生物發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白飼料的工藝，以期對(duì)向日葵花盤(pán)、秸稈蛋白飼料化提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料

將向日葵花盤(pán)、秸稈清洗、晾干，混合粉碎過(guò)篩（40目）后，備用。

1.1.2 菌種

啤酒酵母、安琪酵母、綠色木霉、乳酸菌、枯草芽孢桿菌由河北聯(lián)合大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供。

1.1.3 培養(yǎng)基

啤酒酵母、安琪酵母、綠色木霉：PDA培養(yǎng)基。

乳酸菌：MRS培養(yǎng)基[2]。

枯草芽孢桿菌：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。

1.1.4 主要儀器

HPX-9082MBE數(shù)顯不銹鋼電熱培養(yǎng)箱：上海博訊實(shí)業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；YXQ-280SI型手提式滅菌鍋：上海經(jīng)濟(jì)區(qū)嘉興市中新醫(yī)療儀器有限公司；TDA-8002電熱恒溫水浴鍋：余姚市東方電工儀器廠；KDN-08C凱氏定氮儀：蘇州宏拓電子有限公司。

1.2 方法

1.2.1 向日葵花盤(pán)、秸稈生物蛋白飼料的制備工藝流程（見(jiàn)圖1）

圖1 工藝流程

1.2.2 測(cè)定方法

粗蛋白含量：采用凱氏定氮法[3]測(cè)定；粗纖維含量：采用酸性洗滌劑法[4]測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 單一菌種發(fā)酵向日葵花盤(pán)、秸稈產(chǎn)蛋白飼料

根據(jù)向日葵花盤(pán)、秸稈發(fā)酵對(duì)菌種的要求，分別采用啤酒酵母（A）、安琪酵母（B）、綠色木霉（C）、乳酸菌（D）、枯草芽孢桿菌（E）進(jìn)行單菌發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量(見(jiàn)圖2)。

圖2 不同單一菌種發(fā)酵對(duì)產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

由圖2可知，向固體發(fā)酵培養(yǎng)基中接入單一菌種，與對(duì)照組（CK）相比，均能提高發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量。選擇其中發(fā)酵產(chǎn)物蛋白含量最高的三株菌，枯草芽孢桿菌（8.33%）、啤酒酵母（7.99%）、綠色木霉（7.84%）作為混合菌種發(fā)酵向日葵花盤(pán)、秸稈產(chǎn)蛋白飼料。

2.2 混合菌種發(fā)酵向日葵花盤(pán)、秸稈產(chǎn)蛋白飼料

2.2.1 接種的菌種比例對(duì)向日葵花盤(pán)、秸稈發(fā)酵的影響

分別采用復(fù)配比例分別為1∶1∶1，1∶1∶2，1∶2∶1，2∶1∶1，2∶1∶2，2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進(jìn)行向日葵花盤(pán)、秸稈發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量（見(jiàn)圖3）。

圖3 菌種不同復(fù)配比例對(duì)產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

從圖3可知，當(dāng)啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉復(fù)配比例為2∶2∶1時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量最高，為9.75%。其發(fā)酵產(chǎn)物有酒香，色澤淡黃，干燥后色澤無(wú)大變化。因此，最佳的菌種復(fù)配比例是啤酒酵母∶枯草芽孢桿菌∶綠色木霉為2∶2∶1的混合菌種發(fā)酵向日葵花盤(pán)、秸稈產(chǎn)蛋白飼料，且混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白質(zhì)含量?jī)?yōu)于單菌發(fā)酵。

2.2.2 接種量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

分別采用接種量0.5%、1%、1.5%、2%、2.5%的復(fù)配比例為2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進(jìn)行向日葵花盤(pán)、秸稈發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量(見(jiàn)圖4)。

從圖4可知，隨著接種量的增加，發(fā)酵產(chǎn)物中粗蛋白產(chǎn)量隨之增加，當(dāng)接種量為2%時(shí)，粗蛋白產(chǎn)量達(dá)到最高為11.34%，當(dāng)接種量繼續(xù)增加，粗蛋白產(chǎn)量略有下降，主要是由于接種量過(guò)大，營(yíng)養(yǎng)成分迅速消耗，菌體過(guò)早自溶，不利于粗蛋白的產(chǎn)生。

2.2.3 發(fā)酵時(shí)間對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

采用復(fù)配比例為2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進(jìn)行向日葵花盤(pán)、秸稈發(fā)酵試驗(yàn)，發(fā)酵時(shí)間分別12、24、36、48、60 h時(shí)，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量(見(jiàn)圖5)。

圖4 接種量對(duì)產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

圖5 發(fā)酵時(shí)間對(duì)產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

從圖5可知，隨著發(fā)酵時(shí)間的延長(zhǎng)，粗蛋白含量呈先上升后下降趨勢(shì)，當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為48 h時(shí)，粗蛋白含量達(dá)到最高，故最佳發(fā)酵時(shí)間為48 h。

2.2.4 含水量對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

分別調(diào)整培養(yǎng)基的含水量為20%、40%、60%、80%，采用復(fù)配比例為2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進(jìn)行向日葵花盤(pán)、秸稈發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量(見(jiàn)圖 6)。

圖6 含水量對(duì)產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

由圖6可知，隨著培養(yǎng)基水分的增加，產(chǎn)品粗蛋白含量先增加后降低。當(dāng)基質(zhì)中初始水分含量為40%時(shí)，發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量最高。說(shuō)明此含水量的培養(yǎng)基質(zhì)最適宜微生物生長(zhǎng)繁殖，這可能是因?yàn)榛|(zhì)的細(xì)小顆粒之間存在合適的疏松度，有利于溶氧和CO2的排出，促進(jìn)微生物菌體生長(zhǎng)，從而使發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量增加，因此，適宜的含水量為40%。

2.2.5 培養(yǎng)溫度對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

分別設(shè)置培養(yǎng)溫度為25、29、33、37、41 ℃，采用復(fù)配比例為2∶2∶1的啤酒酵母、枯草芽孢桿菌、綠色木霉混合菌種進(jìn)行向日葵花盤(pán)、秸稈發(fā)酵試驗(yàn)，測(cè)定發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白含量（見(jiàn)圖7）。

圖7 培養(yǎng)溫度對(duì)產(chǎn)物粗蛋白含量的影響

從圖7可以看出，隨著培養(yǎng)溫度的升高，粗蛋白產(chǎn)量呈先上升后下降趨勢(shì)。這是由于枯草芽孢桿菌最適溫度為37℃左右，啤酒酵母和綠色木霉的最適溫度為28℃左右，三種菌的最適溫度不是在同一范圍內(nèi)，因此兼顧到混菌發(fā)酵過(guò)程，當(dāng)發(fā)酵溫度為33℃，此時(shí)的發(fā)酵產(chǎn)品中粗蛋白含量最高。

2.2.6 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析

綜合考慮上述單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在上述實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)接種量、發(fā)酵時(shí)間、含水量和培養(yǎng)溫度L9(34)的正交實(shí)驗(yàn)，因素及水平見(jiàn)表1。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

由表2直觀分析可以看出，對(duì)影響的次序由大到小為A＞C＞B＞D，即接種量＞含水量＞發(fā)酵時(shí)間＞培養(yǎng)溫度，最佳組合方式為A3B3C2D1。表3方差分析可知，接種量和含水量對(duì)產(chǎn)物粗蛋白含量的影響顯著，而發(fā)酵時(shí)間和培養(yǎng)溫度影響不顯著，與直觀分析結(jié)果一致。

表1 正交實(shí)驗(yàn)因素水平

表2 L9(34)正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表3 方差分析

在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行三組平行試驗(yàn)，結(jié)果重現(xiàn)性好，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白含量平均為14.35%，優(yōu)于前述試驗(yàn)效果，故確定混合菌種發(fā)酵向日葵花盤(pán)、秸稈產(chǎn)蛋白飼料的最優(yōu)條件為：接種量2%，發(fā)酵時(shí)間48 h，含水量50%，培養(yǎng)溫度29℃。

2.3 向日葵花盤(pán)、秸稈生物蛋白飼料成分分析

按照上述確定的混合菌種發(fā)酵向日葵花盤(pán)、秸稈產(chǎn)蛋白飼料的最優(yōu)條件進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物的粗蛋白和粗纖維含量進(jìn)行測(cè)定，并與未發(fā)酵的原料進(jìn)行對(duì)比，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 發(fā)酵飼料與原料中各主要成分比較

由表4可知，原料發(fā)酵后，粗蛋白含量由7.45%上升到14.35%，粗蛋白增加率為92.62%。粗纖維素由發(fā)酵前的24.95%減少為21.10%，粗纖維減少率為15.43%，說(shuō)明微生物生長(zhǎng)繁殖將部分碳水化合物與無(wú)機(jī)氮變成菌體蛋白。且發(fā)酵產(chǎn)物有酸甜味和酒香味，無(wú)霉味，色澤淡黃，適口性好，這樣能在一定程度上使其更好的被飼養(yǎng)動(dòng)物吸收，更大的發(fā)揮向日葵花盤(pán)、秸稈的利用價(jià)值。

3 討論

將向日葵花盤(pán)、秸稈轉(zhuǎn)化為蛋白飼料，既可提高其綜合利用價(jià)值，又能緩解蛋白飼料短缺所帶來(lái)的問(wèn)題。本研究對(duì)向日葵花盤(pán)、秸稈轉(zhuǎn)化為蛋白飼料發(fā)酵條件進(jìn)行了探索，比較了單菌發(fā)酵與混菌發(fā)酵生產(chǎn)生物蛋白飼料的工藝，結(jié)果表明，混合菌種發(fā)酵生產(chǎn)的蛋白質(zhì)含量?jī)?yōu)于單菌發(fā)酵；確定了混合菌種發(fā)酵向日葵花盤(pán)、秸稈產(chǎn)蛋白飼料的最優(yōu)條件為：接種量2%，發(fā)酵時(shí)間48 h，含水量50%，培養(yǎng)溫度29℃，在此條件下，發(fā)酵產(chǎn)物粗蛋白由7.45%上升到14.35%，粗蛋白增加率為92.62%，粗纖維素由發(fā)酵前的24.95%減少為21.10%，粗纖維減少率為15.43%。