■ 劉曉慶 朱曉鳴 韓 冬，3 金俊琰 楊云霞 解綬啟

（1.安徽大學資源與環(huán)境工程學院，安徽合肥 230601；2.中國科學院水生生物研究所淡水生態(tài)與生物技術國家重點實驗室，湖北武漢 430072；3.淡水水產(chǎn)健康養(yǎng)殖湖北省協(xié)同創(chuàng)新中心，湖北武漢 430070）

隨著世界漁業(yè)的發(fā)展，用于水產(chǎn)飼料的魚粉供應嚴重不足。在養(yǎng)殖成本上，飼料通常占70%左右，而蛋白源占飼料成本的比例超過60%，因此，使用廉價的植物蛋白源替代魚粉將有利于降低養(yǎng)殖成本[1]。大豆蛋白質(zhì)含量高、氨基酸組成平衡、市場供給穩(wěn)定，被認為是水產(chǎn)動物的優(yōu)質(zhì)飼料原料[2]。大豆原產(chǎn)于我國，主產(chǎn)地東北是世界上最適宜種植大豆的地區(qū)之一，被稱為大豆種植的黃金地帶，國產(chǎn)大豆多為非轉(zhuǎn)基因大豆。在農(nóng)業(yè)生物技術領域，轉(zhuǎn)基因作物研究與開發(fā)在全球范圍內(nèi)取得舉世矚目進展[3]，進口轉(zhuǎn)基因大豆因其出油率比國產(chǎn)大豆高5%左右，能帶來更多經(jīng)濟效益并逐漸進入中國大豆市場。1996年至2004年，跨國公司對中國的大豆出口占中國大豆進口的90%[4]。然而轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑鈍化方法的對比研究至今未見報道。

但是豆類植物的種子均廣泛存在多種類型的抗營養(yǎng)因子，如胰蛋白酶抑制劑、植物凝集素和植酸等，限制了大豆的應用[5]。大豆胰蛋白酶抑制劑（trypsin inhibitor，TI）或稱抗胰蛋白酶因子（anti?trypsin），是一種廣泛存在于自然界的多肽類或蛋白質(zhì)。它對植物本身具有保護作用，可防止大豆籽粒自身發(fā)生分解代謝，使種子處于休眠狀態(tài)，能調(diào)節(jié)大豆蛋白質(zhì)的合成與分解，并具有抗蟲作用，因而是大豆必需成分。然而其對動物胰蛋白酶的抑制作用而使其成為大豆中主要抗營養(yǎng)因子，從而降低了大豆蛋白的營養(yǎng)價值[6]。Westfall等研究發(fā)現(xiàn)，胰蛋白酶抑制劑是導致豆類蛋白質(zhì)利用率下降的最根本原因[7]。飼料中的大豆胰蛋白酶抑制劑會導致魚類氮的內(nèi)源性虧損，從而對魚類產(chǎn)生消極影響。因此，大豆胰蛋白酶抑制劑的鈍化對提高飼料的營養(yǎng)價值和食用安全性具有重大的意義。

眾多學者對大豆胰蛋白酶抑制因子的鈍化方法進行過廣泛研究，加熱（蒸汽烘烤大豆粉）是目前最常用的降低胰蛋白酶抑制劑活性的方法[8]。胰蛋白酶抑制劑活性的降低程度與加熱溫度、加熱時間、顆粒大小以及水分情況相關。實際生產(chǎn)中，這些因素均要小心控制，以免大豆加熱不足或加熱過熟[9]。

本試驗采用干熱法處理轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆粉，測定不同熱處理溫度和時間對大豆胰蛋白酶抑制劑的鈍化效果以及對大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響，以探討大豆粉適宜的熱處理溫度和時間，為大豆的加工處理和水產(chǎn)配合飼料中大豆的廣泛應用提供理論依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗原料

轉(zhuǎn)基因大豆來自阿根廷，水分含量8.36%；非轉(zhuǎn)基因大豆購自湖北農(nóng)業(yè)科學院油料作物研究所，中油35號，水分含量8.66%。

1.2 大豆處理

非轉(zhuǎn)基因和轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)粉碎機粉碎后過80目篩，用四分法取樣。每種大豆粉分別取9份樣品，其中一份作為未處理大豆，其余8份放入鼓風干燥箱中進行熱處理，加熱溫度分別為60、80、100、120℃，加熱時間分別為1 h和2 h。每種大豆粉共9個處理，每個處理3個平行，加熱完畢后放入干燥器中冷卻備用。

1.3 胰蛋白酶抑制劑測試方法

1.3.1 用于胰蛋白酶抑制劑測定的樣品制備

稱取(1.000±0.001)g大豆粉樣品放入燒杯，加入0.01 mol/l NaOH溶液50 ml，將燒杯置于磁力攪拌器上，攪拌20 min后調(diào)節(jié)pH值到9.5，放入4℃冰箱中過夜。從冰箱取出后加4℃蒸餾水至100 ml，靜置15 min后開始試驗。

1.3.2 胰蛋白酶溶液的配制

準確稱取牛胰蛋白酶6.3 mg，溶于50 ml 0.001 mol/l HCl，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.3 牛胰蛋白酶底物N-α-苯甲酰-DL-精氨酰-4-硝基苯胺鹽酸鹽（BAPNA）配制

稱取60 mg BAPNA，加入2 ml二甲基亞砜，5 min后BAPNA完全溶解，加37℃的Tris緩沖液定容到200 ml，37℃保存在棕色試劑瓶中，現(xiàn)配現(xiàn)用。

1.3.4 胰蛋白酶抑制劑活性（TIA）的測定及計算方法

1.3.4.1 TIA測試方法

TIA的測定原理參照AACC 71-10法[10]，即胰蛋白酶作用于反應底物BAPNA，釋放出黃色的對硝基苯胺，在410 nm波長有最大吸收峰;當有胰蛋白酶抑制劑存在時，可以抑制這一反應，使最大吸收峰值下降，其下降程度與TIA呈正比。

試驗操作包括4個組，即試劑對照組、樣品對照組、非抑制組、樣品組。樣品對照組和樣品組分別取制備好的大豆樣品50、100、200 μl加入試管，試劑對照組及非抑制組不加入大豆樣品，所有試管再依次加入50 μl已溫育到37℃的胰蛋白酶液，再分別加入950、900、850、750 μl的反應緩沖液Tris，隨即樣品對照組及試劑對照組分別各加入500 μl 30%冰醋酸溶液搖勻，所有試管37℃水浴20 min，結束后按順序依次加入2.5 ml BAPNA搖勻，非抑制組和樣品組在加入BAPNA后計時20 min，依次加入500 μl 30%醋酸，搖勻。當反應停止后，3 500 r/min離心10 min，在410 nm下使用多功能酶標儀測定OD值。

1.3.4.2 TIA及相對抑制率值的計算

以未添加胰蛋白酶抑制劑樣品組數(shù)據(jù)為0刻度，將數(shù)據(jù)做回歸曲線，TIA值計算公式：

TIA（mg/g）=回歸曲線系數(shù)（OD/ml）×胰蛋白酶質(zhì)量（mg）×添加的NaOH體積（ml）/[胰蛋白酶抑制劑樣品質(zhì)量（g）×非抑制組OD值]；

相對抑制率（%）=（熱處理后大豆測定TIA/相應未處理大豆測定TIA）×100。

每個樣品測定3次作為平行。

1.3.5 蛋白質(zhì)溶解度測試方法及結果計算

1.3.5.1 蛋白質(zhì)溶解度（PS）測定[11]

稱取1.5 g粉碎過篩處理后的大豆粉，放入燒杯中，加入75 ml 0.2%的KOH溶液，在磁力攪拌器中攪拌20 min。將攪拌好的液體轉(zhuǎn)入離心管中，以2 700 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min。離心停止以后，吸取上清液15 ml，放入消化管中，用凱氏定氮法測定其中蛋白質(zhì)含量，此含量相當于0.3 g試樣中溶解在0.2%KOH里的蛋白質(zhì)的量。

1.3.5.2 蛋白質(zhì)溶解度（PS）的結果計算

蛋白質(zhì)溶解度（%）=15 ml上清液中粗蛋白質(zhì)的質(zhì)量/0.3 g樣品中粗蛋白含量×100。

每個樣品測定3次作為平行。

2 試驗結果

2.1 加熱對大豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響

胰蛋白酶抑制劑在大豆中的各部位均有分布，但主要存在于大豆的種子中。大豆種子中胰蛋白酶抑制劑的含量可達總蛋白的6%～8%[12]。經(jīng)過60～120℃不同加熱處理后大豆中胰蛋白酶抑制劑的活性變化如圖1～圖3及表1、表2所示。

圖1 1 h不同加熱溫度對胰蛋白酶抑制劑活性的影響

圖1表明，同一處理條件下，非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性（TIA）均較轉(zhuǎn)基因大豆的低，未處理組非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性比轉(zhuǎn)基因大豆的低9.91%。干熱處理可以降低轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因大豆的TIA值（P＜0.05）。轉(zhuǎn)基因大豆在60℃和80℃的加熱溫度下加熱1 h，胰蛋白酶抑制劑活性（TIA）降低的不是很快（如圖3所示，相對抑制率分別為7.99%和11.1%），與未處理組無顯著性差異(P＞0.05)。由圖1可知，當溫度升至100℃，甚至120℃時，其活性迅速下降，與未處理組存在統(tǒng)計學差異（P＜0.05）。經(jīng)過1 h加熱，轉(zhuǎn)基因大豆的TIA總體仍維持在較高水平，120℃熱處理組的TIA為未處理組的56.43%。非轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)各處理溫度1 h加熱后，大豆胰蛋白酶抑制劑活性亦迅速降低（P＜0.05）。除60℃組與未處理組無統(tǒng)計學差異外(P＞0.05)，其它各組與未處理組相比差異顯著(P＜0.05)。非轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)120℃、1 h加熱后，TIA已降至未處理時的28.80%。

圖2 2 h不同加熱溫度對胰蛋白酶抑制劑活性的影響

圖3 不同熱處理對胰蛋白酶抑制劑相對抑制率的影響

表1 不同加熱溫度和時間對轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性影響的方差分析

表2 不同加熱溫度和時間對非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性影響的方差分析

如圖2所示，加熱時間延長至2 h時，60℃處理即可使轉(zhuǎn)基因大豆TIA迅速降低至較低水平，胰蛋白酶抑制劑的相對抑制率達到42.19%。之后，隨著溫度的上升，大豆胰蛋白酶抑制劑活性繼續(xù)降低，但降低幅度有所減小。除80℃和100℃熱處理組間無統(tǒng)計學差異外(P＞0.05)，其它各組間均存在顯著性差異(P＜0.05)。與轉(zhuǎn)基因大豆相似，非轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)過60℃、2 h加熱，TIA亦迅速降低至較低水平。之后，隨著溫度的升高，大豆TIA下降幅度均較小，60、80、100℃熱處理組間均無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。120℃、2 h可有效抑制大豆TIA，在該條件下轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性的相對抑制率分別為73.64%和78.79%。

如圖3所示，胰蛋白酶抑制因子的相對抑制率隨著加熱時間和溫度的變化而變化。由表1、2可知，不同加熱溫度和時間對轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性的影響無交互作用。轉(zhuǎn)基因大豆及非轉(zhuǎn)基因大豆經(jīng)過120℃、2 h的熱處理后相對抑制率均達到70%以上，非轉(zhuǎn)基因大豆的相對抑制率幾乎每種處理下都高于轉(zhuǎn)基因大豆。

2.2 加熱對大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響

經(jīng)過不同溫度（60～120℃）、不同加熱時間（1、2 h）處理后大豆中蛋白質(zhì)溶解度的變化如圖4及表3、表4所示。隨著加熱溫度的升高，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的蛋白質(zhì)溶解度均發(fā)生波動，且呈現(xiàn)出無規(guī)則的變化趨勢。試驗結果顯示，各組大豆的蛋白質(zhì)溶解度均在69.85%至78.06%之間。由表3、4可知，不同加熱溫度和時間對轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆蛋白質(zhì)溶解度的影響有交互作用。

圖4 不同熱處理對蛋白質(zhì)溶解度的影響

表3 不同加熱溫度和時間對轉(zhuǎn)基因大豆蛋白質(zhì)溶解度影響的方差分析

表4 不同加熱溫度和時間對非轉(zhuǎn)基因大豆蛋白質(zhì)溶解度影響的方差分析

3 討論

3.1 大豆胰蛋白酶抑制劑及其鈍化方法探討

國內(nèi)外大豆胰蛋白酶抑制劑的研究有較長歷史[13]，目前國外研究較多地集中在胰蛋白酶抑制劑的結構及其與靶酶的作用機理、胰蛋白酶抑制劑的基因表達等方面。國內(nèi)近年對飼料中胰蛋白酶抑制劑的去除方法及其效果開展了一些研究，對生產(chǎn)實踐起到了指導作用[14]。大豆胰蛋白酶抑制劑等抗營養(yǎng)因子的鈍化方法有物理方法、化學方法和生物學方法。化學處理方法的原理為化學物質(zhì)與抗營養(yǎng)因子中的二硫鍵結合，使其分子結構改變而失去活性，但是具有藥品殘留的問題。理論上講，生物學方法是降解大豆抗營養(yǎng)因子最徹底的手段，但是酶制劑的耐受性、穩(wěn)定性以及影響酶制劑作用的外在因素等問題有待進一步深入研究[15]。物理方法是最常用的方法，利用胰蛋白酶抑制劑的熱敏感性對抑制劑進行鈍化處理。在未來的研究中我們需注重不同鈍化方法的交叉結合工藝創(chuàng)新，做到在不影響大豆及其制品營養(yǎng)成分流失的前提下，最大限度去除抗營養(yǎng)因子。

3.2 轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的對比研究

大豆、菜籽和玉米都是魚粉的優(yōu)質(zhì)替代蛋白源，目前國際市場上提供的這些原料大部分都是轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品[16]。水產(chǎn)飼料中使用轉(zhuǎn)基因作物對養(yǎng)殖魚類的安全和質(zhì)量的影響需要進行研究和評價。Sanden等（2004）[16]指出，水產(chǎn)飼料使用轉(zhuǎn)基因大豆的影響主要出于兩方面的考慮：①養(yǎng)殖魚類的安全，是否影響魚類的生理、生化指標，尤其是生長；②食品安全，轉(zhuǎn)基因片段轉(zhuǎn)移并殘留于魚體。Hammond等(1996)[17]和 Padgette等(1995)[18]使用轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆對鯰進行養(yǎng)殖試驗，發(fā)現(xiàn)鯰的增重和魚體成分等參數(shù)均無顯著差異。Sanden等（2004）[16]研究也發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭攝食轉(zhuǎn)基因大豆的飼料后，生長狀態(tài)與攝食非轉(zhuǎn)基因大豆飼料的對照組一致，且轉(zhuǎn)基因片段不殘留于魚體組織。這些研究均符合轉(zhuǎn)基因食品營養(yǎng)評價原則上應遵循“實質(zhì)等同”的判斷標準，即轉(zhuǎn)基因食品的營養(yǎng)價值應與親本食品沒有差別。就本試驗檢測的產(chǎn)品而言，各處理組轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性均高于非轉(zhuǎn)基因；并且大豆經(jīng)過高溫加熱處理之后胰蛋白酶抑制劑活性可被有效滅活。

3.3 加熱對胰蛋白酶抑制劑的影響

大豆胰蛋白酶抑制劑是大豆中主要的抗營養(yǎng)因子，目前被發(fā)現(xiàn)的有7～10種，其中兩種研究的較為詳細，即 Kunitz(KTI)和 Bowman-Birk(BBI)[19]。Kunitz型抑制因子有一個活性中心，可等量結合腸道胰蛋白酶，被稱為單頭抑制；Bowman-Birk型抑制因子有兩個活性中心，可分別結合胰蛋白酶和糜蛋白酶，被稱為雙頭抑制。由于結構上的差異，KTI對抗酸、抗熱的能力比BBI要弱。加熱會使大豆胰蛋白酶抑制劑失活，但是熱處理效果受到大豆品種、含水量、顆粒大小及加熱溫度、壓力和時間的影響。Gujska等(1991)[20]報道，加熱溫度在130～140℃之間，不論熱處理過程壓力多大、顆粒形狀大小如何，均可以有效地鈍化超過85%的胰蛋白酶抑制劑。本試驗中，轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑活性均隨著加熱溫度的升高和加熱時間的延長而降低。這與梁玉梅等（2006）[21]和 Anderson（1992）[22]的研究結果一致。加熱時間為1 h時，非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性降低的幅度大于轉(zhuǎn)基因大豆，即非轉(zhuǎn)基因大豆胰蛋白酶抑制劑活性對于熱處理更為敏感，這可能與轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆中不同類型胰蛋白酶抑制劑的含量不同有關，有待進一步研究。

對大豆熱處理適宜程度一般是以抗營養(yǎng)因子的活性來判斷的。Honig等(1987)[23]、Liener(1994)[9]、林建斌等（1999）[24]的研究認為，大豆胰蛋白酶抑制劑活性只要失活75%～85%，大豆蛋白質(zhì)的營養(yǎng)效價最高。本試驗中，轉(zhuǎn)基因大豆和非轉(zhuǎn)基因大豆通過120℃、2 h的熱處理都達到了胰蛋白酶抑制劑活性失活73.64%～78.79%的程度，因此120℃、2 h可以作為本試驗中最優(yōu)處理條件。

3.4 加熱對蛋白質(zhì)溶解度的影響

加熱程度對大豆的營養(yǎng)品質(zhì)影響較大。加熱不足，胰蛋白酶抑制劑破壞不充分，降低蛋白質(zhì)的消化率；加熱過度，雖然胰蛋白酶抑制劑已失活，但會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，溶解度降低，特別是引起賴氨酸、精氨酸和胱氨酸的破壞或消化率降低[25]。目前，國內(nèi)外并無以蛋白質(zhì)溶解度評價大豆的生熟度的統(tǒng)一標準。楊秀文等（1995）[26]用肉雞做試驗，以蛋白質(zhì)溶解度為判斷指標，認為PS＞85%時為過生，70%≤PS≤85%時為加熱正常，PS＜70%時為加熱過熟；梁邢文（1995）[27]認為，蛋白質(zhì)溶解度在60%～80%之間為加熱適度；曹志華等（2004）[28]研究認為，大豆加熱過生時，PS＞87%，而過熟則PS＜41%。從本試驗的結果可看出，各組大豆的蛋白質(zhì)溶解度均在69.85%至78.06%之間，屬于正常加熱。但是隨著加熱溫度的升高，大豆蛋白質(zhì)溶解度發(fā)生無規(guī)則波動。因此，推測蛋白質(zhì)溶解度不是評判大豆生熟度的最適指標。

4 結論

水產(chǎn)飼料中魚粉的需求量和價格的不斷上升以及產(chǎn)量的日趨下降，尋找優(yōu)質(zhì)的替代蛋白源已成為水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)可持續(xù)發(fā)展的關鍵問題。大豆作為優(yōu)質(zhì)魚粉替代物被廣泛地加以研究，然而胰蛋白酶抑制劑的存在限制了其應用。因此，對大豆胰蛋白酶抑制劑的鈍化研究十分必要。本試驗結果表明，轉(zhuǎn)基因大豆含有較高的胰蛋白酶抑制劑；隨著加熱溫度的提高和加熱時間的延長，轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因大豆的胰蛋白酶抑制劑的活性逐漸降低；加熱處理與大豆蛋白質(zhì)溶解度的相關性差。