顧瑾麟，張紅發(fā)，夏永軍，任 靜

（光明乳業(yè)股份有限公司乳業(yè)研究院，乳業(yè)生物技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海200436）

蛋白酶是催化蛋白質(zhì)水解的一類酶，主要存在于動(dòng)物內(nèi)臟、植物莖葉、果實(shí)和微生物中[1]，既可以從動(dòng)植物組織中提取，也可以通過(guò)微生物發(fā)酵工藝進(jìn)行生產(chǎn)，是一類廣泛應(yīng)用于食品、紡織、醫(yī)藥、有機(jī)合成、洗滌劑及制革脫毛等方面的重要工業(yè)和研究用酶，其份額占整個(gè)酶制劑市場(chǎng)的一半以上[2]。微生物來(lái)源的蛋白酶，生產(chǎn)周期短、生產(chǎn)成本低、不受土地和季節(jié)限制，多為胞外酶，純化制備相對(duì)容易，規(guī)?；a(chǎn)的成本會(huì)大大降低。

考察培養(yǎng)基組分對(duì)產(chǎn)酶影響的傳統(tǒng)方法有單因子實(shí)驗(yàn)、全因子實(shí)驗(yàn)等。因其未考慮各因素之間的交互作用，故不能實(shí)現(xiàn)真正的最優(yōu)化，且當(dāng)因素較多時(shí)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)太多[3]。響應(yīng)面法（Response surface methodology，RSM）是一種集實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、模型建立、各因素重要性的評(píng)估和各因素最優(yōu)水平的確定的一種統(tǒng)計(jì)學(xué)方法，是重要的過(guò)程優(yōu)化工具，它能迅速高效地確定多因子系統(tǒng)的最佳條件[4]。近年來(lái)采用響應(yīng)面法對(duì)微生物發(fā)酵產(chǎn)酶培養(yǎng)基優(yōu)化已有一些報(bào)道，并取得了較好的優(yōu)化結(jié)果。Papagora C等[5]從干腌橄欖中分離得到菌株Debaryomyces hansenii YLL29，通過(guò)響應(yīng)面法優(yōu)化，其胞外脂肪酶活力達(dá)7.44U/m L，是未優(yōu)化前的2.28倍。K N Niladevid等[6]通過(guò)響應(yīng)面法將絲狀菌鏈霉菌psammoticus ATCC 7334深層發(fā)酵產(chǎn)漆酶的含量提高了3倍。Yishan Su等[7]從泰山分離到產(chǎn)熱穩(wěn)定木聚糖酶菌株Thermomyces lanuginosus SDYKY-1，通過(guò)中心組合設(shè)計(jì)與響應(yīng)面法優(yōu)化，將其木聚糖酶活力提高144%，為3078U/m L。

本文以實(shí)驗(yàn)室分離保存的一株對(duì)脫脂乳平板有明顯水解圈的菌株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象，經(jīng)鑒定為嗜麥芽窄食單胞菌（Kx-7），原始酶活為146.43U/m L。為了提高Kx-7產(chǎn)蛋白酶活力，以單因素實(shí)驗(yàn)為基礎(chǔ)，并以篩選出的因素水平為變量，以蛋白酶酶活為響應(yīng)值，運(yùn)用響應(yīng)面法對(duì)培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，以期獲得最佳發(fā)酵培養(yǎng)基配比。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜麥芽窄食單胞菌（Kx-7） 由本實(shí)驗(yàn)室分離保存；脫脂奶粉、福林試劑、碳酸鈉、三氯乙酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、干酪素、氫氧化鈉、酪氨酸、葡萄糖、D-果糖、蔗糖、α-乳糖、淀粉、麥芽糖、酪蛋白、胰蛋白胨、酵母浸出粉、大豆蛋白胨、硝酸鈉、尿素、硫酸銨、Triton X-100、十二烷基硫酸鈉（SDS）、吐溫-60、吐溫-20、吐溫-80 均為國(guó)產(chǎn)分析純；種子培養(yǎng)基（LB培養(yǎng)基） 胰蛋白胨10g/L、酵母提取物5g/L、氯化鈉10g/L，pH自然；原始發(fā)酵培養(yǎng)基 D-果糖30g/L、酪蛋白5g/L、Na2HPO4·2H2O 6g/L、KCl 1g/L、MgSO4·7H2O 0.1g/L，pH自然。以上培養(yǎng)基于121℃滅菌20m in。

BPH-9082恒溫培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；ZHWY-2102C雙層恒溫?fù)u床 上海智成分析儀器制造有限公司；Purifier RlogicTM 4英尺TypeA2生物安全柜 美國(guó)LABCONCO；MLS-3750高壓滅菌鍋日本SANYO；M inispin p lus臺(tái)式離心機(jī) 德國(guó)艾本德eppendorf；AL104梅特勒分析天平、PL2002梅特勒便攜式天平 瑞士梅特勒-托利多；SpectraMax M 5酶標(biāo)儀 美國(guó)Molecular Devices公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 蛋白酶活力測(cè)定方法 參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)《蛋白酶活力測(cè)定法》[8]。酶活力單位定義為：在 40℃下每分鐘水解酪蛋白產(chǎn)生lμg酪氨酸，定義為1個(gè)蛋白酶活力單位。

1.2.2 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.2.1 碳源對(duì)酶活的影響 以接種量為5%（v/v）的菌液轉(zhuǎn)接于分別添加了6種不同碳源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，碳源分別為α-乳糖、蔗糖、淀粉、麥芽糖、D-果糖、葡萄糖，均30g/L；180r/m in，30℃振蕩培養(yǎng)，30h后測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1.2.2.2 氮源對(duì)酶活的影響 以接種量為5%（v/v）的菌液轉(zhuǎn)接于分別添加了7種不同氮源的發(fā)酵培養(yǎng)基中，氮源分別為大豆蛋白胨、胰蛋白胨、酵母侵出粉、硫酸銨、尿素、硝酸鈉、酪蛋白，均5g/L；以1.2.2.1中蛋白酶活力最高的因素為碳源，180r/m in，30℃振蕩培養(yǎng)，30h后測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1.2.2.3 表面活性劑對(duì)酶活的影響 以接種量為5%（v/v）的菌液轉(zhuǎn)接于分別添加了5種表面活性劑的發(fā)酵培養(yǎng)基中，表面活性劑分別為吐溫20、吐溫60、吐溫80、Triton X-100均4m L/L，SDS 0.2g/L；以1.2.2.1和1.2.2.2中影響酶活最高的因素為碳源和氮源，同時(shí)以不添加表面活性劑為空白對(duì)照，180r/m in，30℃的條件下振蕩培養(yǎng)，30h后測(cè)定發(fā)酵液中蛋白酶活力。

1.2.3 響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定最佳碳源、氮源、表面活性劑及其相應(yīng)濃度范圍后，用Design Expert 7.0軟件，根據(jù)Box-Behnken模型的中心組合實(shí)驗(yàn)原理設(shè)計(jì)三因素三水平的Box-Behnken實(shí)驗(yàn)。以D-果糖（X1）、酪蛋白（X2）和Triton-100（X3）三個(gè)因素為自變量，以蛋白酶酶活（Y）為響應(yīng)值，對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸性分析，用t檢驗(yàn)驗(yàn)證回歸系數(shù)的顯著性，用F檢驗(yàn)評(píng)價(jià)模型方程的顯著性，方程的擬合性由R2確定。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素及水平見(jiàn)表1。

表1 響應(yīng)面法分析因素及水平表Table1 Factors and levels for response surface analysis

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 不同碳源對(duì)蛋白酶酶活的影響Fig.1 Effectof different carbon sources on enzyme activity of protease

圖2 D-果糖濃度對(duì)蛋白酶酶活的影響Fig.2 Effect of D-fructose concentration on enzyme activity of protease

2.1.1 不同碳源對(duì)酶活的影響 微生物細(xì)胞含碳量約占干重的50%，故除水分外，碳源是需要量最大的營(yíng)養(yǎng)素[9]，因此選擇合適的碳源對(duì)菌體的生長(zhǎng)以及產(chǎn)酶都極為重要。由圖1可見(jiàn)，當(dāng)以酪蛋白為氮源時(shí)，碳源對(duì)Kx-7產(chǎn)酶的影響依次是D-果糖＞蔗糖＞α-乳糖＞淀粉＞麥芽糖。碳源為D-果糖時(shí)，蛋白酶活力最高為204.04U/m L，具有顯著效應(yīng)?？赡苡捎贒-果糖為單糖，不需要再水解，相對(duì)于雙糖和多糖更便于Kx-7吸收所利用。由圖2可見(jiàn)，當(dāng)D-果糖濃度為20g/L時(shí)，蛋白酶活力最高為229.02U/m L，過(guò)高或過(guò)低的糖濃度都不利于該菌株生長(zhǎng)。這是由于糖濃度過(guò)低不能提供足夠的能量和物質(zhì)來(lái)源；而糖濃度過(guò)高一方面會(huì)引起發(fā)酵液中滲透壓過(guò)高，使細(xì)胞失水，生長(zhǎng)受到抑制，另一方面糖濃度過(guò)高使代謝產(chǎn)物增加，發(fā)酵液pH降低，不利于菌株生長(zhǎng)。

2.1.2 氮源對(duì)酶活的影響 由圖3可見(jiàn)，氮源對(duì)Kx-7產(chǎn)酶的影響依次是酪蛋白＞胰蛋白胨＞大豆蛋白胨＞硝酸鈉＞尿素，使用有機(jī)氮源（酪蛋白、胰蛋白胨、大豆蛋白胨）時(shí)，Kx-7產(chǎn)酶酶活明顯高于無(wú)機(jī)氮源（尿素、硝酸鈉），其原因可能是有機(jī)氮源中含有的無(wú)機(jī)鹽、較豐富的B族維生素及生長(zhǎng)因子促進(jìn)了蛋白酶的產(chǎn)生[10]，無(wú)機(jī)氮源成分較單一，影響產(chǎn)酶量。3種有機(jī)氮源中，酪蛋白效果最好，酶活力達(dá)到257.67U/m L，可見(jiàn)酪蛋白具有顯著效應(yīng)。其原因可能是動(dòng)物蛋白（酪蛋白、胰蛋白胨）比植物蛋白（大豆蛋白胨）對(duì)Kx-7產(chǎn)酶具有更好的促進(jìn)作用。由圖4可見(jiàn)，當(dāng)酪蛋白濃度為5g/L時(shí)，蛋白酶活力最高為261.05U/m L，這是因?yàn)闈舛冗^(guò)高導(dǎo)致C/N比降低，不利于蛋白酶積累；濃度過(guò)低不能得到理想的菌濃度，同樣不利于蛋白酶的產(chǎn)生。

圖3 不同氮源對(duì)蛋白酶酶活的影響Fig.3 Effectof nitrogen sources on enzyme activity of protease

圖4 酪蛋白濃度對(duì)蛋白酶酶活的影響Fig.4 Effectof casein concentration on enzyme activity of protease

2.1.3 表面活性劑對(duì)酶活的影響 由圖5可見(jiàn)，表面活性劑對(duì)Kx-7產(chǎn)酶的影響依次為Triton X-100＞SDS＞空白對(duì)照＞吐溫-60＞吐溫-20＞吐溫-80。Triton X-100和SDS對(duì)Kx-7產(chǎn)蛋白酶活力有較大的促進(jìn)作用，酶活分別達(dá)到290.72U/m L和283.79U/m L，可見(jiàn)Triton X-100具有顯著效應(yīng)。而表面活性劑吐溫-20、吐溫-60、吐溫-80對(duì)Kx-7產(chǎn)蛋白酶活力沒(méi)有明顯影響。由圖6可見(jiàn)，當(dāng)Triton X-100濃度為4m L/L時(shí)，蛋白酶活力最高為284.50U/m L。表面活性劑在微生物發(fā)酵中的主要作用是提高細(xì)胞膜的滲透性，減少氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)進(jìn)入細(xì)胞的傳遞阻力，從而提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量[11]。蛋白酶活力與Triton X-100呈現(xiàn)一定程度的濃度依賴性，低濃度時(shí)對(duì)蛋白酶活力有促進(jìn)作用，高濃度則有抑制作用。

圖5 不同表面活性劑對(duì)蛋白酶酶活的影響Fig.5 Effectof Surfactants on enzyme activity of protease

圖6 Triton X-100濃度對(duì)蛋白酶酶活的影響Fig.6 Effectof Triton X-100 concentration on enzyme activity of protease

2.2 響應(yīng)面分析

2.2.1 響應(yīng)面回歸模型的建立和分析 根據(jù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果，確定D-果糖、酪蛋白、Triton X-100為影響Kx-7產(chǎn)蛋白酶的關(guān)鍵因素，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果如表2所示。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項(xiàng)式回歸擬合后，獲得嗜麥芽窄食單胞菌Kx-7產(chǎn)酶酶活對(duì)D-果糖、酪蛋白、Triton X-100的二次多項(xiàng)式回歸方程為：

此模型相關(guān)系數(shù)R2=0.9425，這說(shuō)明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間有較好的擬合度。該二次項(xiàng)方程及各項(xiàng)方差分析如表3所示，模型p值為0.0127，說(shuō)明模型顯著（p＜0.05），失擬項(xiàng)p值為0.1217，說(shuō)明由誤差引起模型偏差的概率為12.17%，模型失擬項(xiàng)不顯著（p＞0.05）。方程中獨(dú)立變量X1、X2、X3不顯著性，這表明僅隨單因素濃度的增加蛋白酶活力增加不顯著。在交互項(xiàng)中，X1X2、X1X3顯著（p＜0.05）。X、X、X對(duì)響應(yīng)值影響顯著（p＜0.05）。

2.2.2 交互作用分析 經(jīng)Design Expert軟件分析可得到3個(gè)顯著影響因子之間的響應(yīng)面分析圖（如圖7～圖9所示），相比于二次回歸方程，響應(yīng)面圖能直觀的顯示3種因素的交互作用和對(duì)Kx-7產(chǎn)蛋白酶的影響，每組響應(yīng)面圖譜都有明顯的頂峰，證實(shí)影響因素的最佳值落在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的取值范圍內(nèi)。通過(guò)響應(yīng)面圖3種因素的最佳值可以得到預(yù)測(cè)，最大蛋白酶活力值在響應(yīng)面的最高點(diǎn)處[12]。3種因素中X1與X2，X1與X3之間有顯著的交互作用，X2與X3的交互作用不顯著（p＞0.05）。三因素的交互響應(yīng)曲面圖見(jiàn)圖7～圖9。

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table2 Design and results of Box-Behnken experiment

表3 響應(yīng)面結(jié)果方差分析Table3 Variance analysis of response surfacemethod design result

2.3 嗜麥芽窄食單胞菌（Kx-7）產(chǎn)蛋白酶最優(yōu)培養(yǎng)基配方的獲取與驗(yàn)證

對(duì)回歸方程進(jìn)行進(jìn)一步分析，得到的最優(yōu)發(fā)酵培養(yǎng)基組成為D-果糖19.15g/L，酪蛋白4.05g/L，Triton X-100 5.10m L/L時(shí)，理論上嗜麥芽窄食單胞菌（Kx-7）產(chǎn)蛋白酶活力的最大值為321.30U/m L。根據(jù)上述回歸分析結(jié)果和響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)特點(diǎn)，通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，發(fā)酵30h后實(shí)際蛋白酶活力為（324.56±0.31）U/m L，與理論值較接近，預(yù)測(cè)精度達(dá)98.99%，可見(jiàn)該模型能較好地預(yù)測(cè)Kx-7實(shí)際產(chǎn)蛋白酶情況。從而用響應(yīng)面法優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基可為今后Kx-7的培養(yǎng)和開(kāi)發(fā)利用提供必要的理論基礎(chǔ)。

圖7 D-果糖和酪蛋白交互作用對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.7 Effectof D-fructose and casein on enzyme activity of protease

圖8 D-果糖和曲拉通-100交互作用對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.8 Effectof D-fructose and Triton X-100 on enzyme activity of protease

圖9 酪蛋白和曲拉通-100交互作用對(duì)蛋白酶活力的影響Fig.9 Effect of casein and Triton X-100 on enzyme activity of protease

3 結(jié)論

蛋白酶具有重要的工業(yè)和研究應(yīng)用價(jià)值，通過(guò)篩選高產(chǎn)菌種，優(yōu)化發(fā)酵條件來(lái)提高蛋白酶產(chǎn)量是降低其工業(yè)應(yīng)用成本的有效手段。影響微生物產(chǎn)酶的因素主要有3方面，即微生物菌株的自身優(yōu)劣，培養(yǎng)基組成和培養(yǎng)條件[13]。嗜麥芽窄食單胞菌（Kx-7）為本實(shí)驗(yàn)室篩選的蛋白酶高產(chǎn)菌株，從優(yōu)化培養(yǎng)基組分出發(fā)，首先采用單因素實(shí)驗(yàn)確定了嗜麥芽窄食單胞菌Kx-7產(chǎn)蛋白酶適宜的碳源、氮源及表面活性劑，分別為果糖，酪蛋白和Triton X-100，并分別確定了各自的適宜濃度范圍。利用Box-Behnken實(shí)驗(yàn)對(duì)Kx-7產(chǎn)蛋白酶的發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果表明當(dāng)果糖的濃度為19.15g/L，酪蛋白濃度為4.05g/L，曲拉通的濃度為5.1m L/L時(shí)，Kx-7的蛋白酶活力達(dá)到324.56U/m L，比優(yōu)化前提高了1.2倍。該結(jié)果表明，采用響應(yīng)面法來(lái)提高嗜麥芽窄食單胞菌（Kx-7）蛋白酶產(chǎn)量是可行的，具有一定實(shí)用價(jià)值。

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