王金鵬，焦愛(ài)權(quán)，周 星，趙建偉，田耀旗，金征宇

（江南大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江南大學(xué)食品學(xué)院，江蘇無(wú)錫214122）

大環(huán)糊精（LR-CD）是由α-1，4糖苷鍵鏈接構(gòu)成的、聚合度大于9的環(huán)狀葡聚糖總稱，具有不同于常見(jiàn)環(huán)糊精的結(jié)構(gòu)特征，例如CD10呈現(xiàn)馬鞍形，CD26呈現(xiàn)雙螺旋型[1]，這些特殊的結(jié)構(gòu)使得大環(huán)糊精具有極高的水溶性（＞1.5mg/m L）。目前已經(jīng)有少量研究報(bào)道證實(shí)了大環(huán)糊精能夠顯著增加客體分子的溶解度，例如Furuishi[2]報(bào)道了采用CD9包埋富勒烯（C60）能夠極好地增加其水溶性，Dodziuk[3]報(bào)道了CD12能夠與十二烯形成穩(wěn)定的復(fù)合物，Tomoono等研究了DPs 20-50 LR-CD對(duì)強(qiáng)的松龍、膽固醇、地高辛、洋地黃毒苷、硝化甘油等物質(zhì)的包埋增溶效果[4]，Machida等將DPs 20-45 LR-CD用做輔助人工蛋白折疊[5]，Mun等將DPs 22-44的LR-CD用做表面活性劑的包埋[6]。這些報(bào)道為大環(huán)糊精的應(yīng)用提供了參考。

然而，與常見(jiàn)環(huán)糊精的諸多應(yīng)用報(bào)道相比，大環(huán)糊精的應(yīng)用報(bào)道還非常少。為進(jìn)一步擴(kuò)展大環(huán)糊精的應(yīng)用范圍，充分發(fā)揮大環(huán)糊精的高水溶特性，本文以制霉菌素為客體，研究大環(huán)糊精對(duì)制霉菌素的增溶效果。制霉菌素是廣譜的抗真菌劑，然而制霉菌素的不飽和雙鍵結(jié)構(gòu)在空氣中很容易被氧化降解，并且，制霉菌素的水溶性特別差，這大大降低了其藥物效果[7]。本文作者研究發(fā)現(xiàn)常見(jiàn)環(huán)糊精能夠在不改變制霉菌素本身結(jié)構(gòu)的情況下促進(jìn)制霉菌素水溶性提高[8]，除此之外，未見(jiàn)其他不改變制霉菌素結(jié)構(gòu)以增加其水溶性的相關(guān)報(bào)道。而LR-CD具有顯著優(yōu)于常見(jiàn)環(huán)糊精的水溶特性，將會(huì)造成制霉菌素顯著的增溶效果，這對(duì)于改善制霉菌素的局部抗菌作用、治療真菌感染類疾病將具有重要意義。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

LR-CD混合物日本格力高有限公司，平均分子量為7720u；制霉菌素 分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)；α-、β-、γ-環(huán)糊精 為分析純，購(gòu)自Sigma公司；乙醇等其他試劑 均為分析純，購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)。

AB104-N電子天平 美國(guó)梅特勒托利多公司；KQ5200超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；HZS-H超級(jí)水浴恒溫振蕩器 哈爾濱東聯(lián)電子技術(shù)公司；RJ-TDL-50A低速臺(tái)式大容量離心機(jī) RUIJIANG；TU-1900雙光束紫外可見(jiàn)分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司。

1.2 制霉菌素的定量分析

采用紫外分光光度法對(duì)制霉菌素進(jìn)行定量測(cè)定[8]。首先制作制霉菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線，具體步驟如下：分別取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5m L 50%乙醇溶解的制霉菌素（2mg/m L）到10m L試管中，再分別添加50%乙醇4.5、4.0、3.5、3.0、2.5m L使溶液總體積為5m L，漩渦混合器上混合均勻后測(cè)定305nm處的吸光值，以制霉菌素的濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3 包埋時(shí)間的確定

稱取LR-CD 0.1g，加水定容至100m L容量瓶，配制成1mg/m L的溶液，轉(zhuǎn)移至棕色試劑瓶中超聲5m in，充氮，40℃、150r/min振蕩水浴蕩搖，每隔2、4、6、8、10、12、24、48、72h用10m L針筒抽取4m L上清液過(guò)0.45μm針頭式濾器過(guò)濾注入10m L容量瓶，加50%乙醇定容稀釋至刻度，用紫外分光光度計(jì)于304nm波長(zhǎng)處測(cè)其吸光值。

1.4 相溶解度圖的測(cè)定

為進(jìn)一步解析大環(huán)糊精對(duì)于制霉菌素的包埋特點(diǎn)，以常見(jiàn)三種環(huán)糊精的相溶解度圖作為對(duì)照進(jìn)行對(duì)比研究。準(zhǔn)確稱取1gα-CD、β-CD、γ-CD，加去離子水使之溶解，裝入100m L容量瓶，定容使其濃度為10mg/m L，然后分別稀釋成濃度為0、100、300、500、700、900μg/m L，3、5mg/m L各10m L裝入棕色瓶中，準(zhǔn)確稱取制霉菌素0.01g，置于各個(gè)瓶中，搖勻，充氮排盡瓶中空氣，然后放入電熱恒溫振蕩水槽，于40℃、150r/m in振蕩48h。振蕩結(jié)束后取出樣品，經(jīng)0.45μm濾膜過(guò)濾，取300μL過(guò)濾液加2700μL 50%的乙醇溶液，測(cè)定305nm下的吸光度值，代入制霉菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，求出溶解在水中的制霉菌素的量，以三種環(huán)糊精的濃度為橫坐標(biāo)，制霉菌素的濃度為縱坐標(biāo)繪制曲線，即為相溶解度圖。

測(cè)定LR-CD時(shí)，準(zhǔn)確稱取0.1g LR-CD，加去離子水使之溶解并裝入100m L容量瓶定容使其濃度為為1mg/m L，然后分別稀釋成濃度為0、100、300、500、700、900μg/m L，各取10m L裝入棕色瓶中，準(zhǔn)確稱取制霉菌素0.01g置于各個(gè)瓶中，搖勻，充氮排盡瓶中空氣，然后放入電熱恒溫振蕩水槽，于40℃、150r/m in振蕩48h，振蕩結(jié)束后取出并采用0.45μm濾膜過(guò)濾處理，分別取300μL濾液，加2700μL 50%的乙醇溶液，測(cè)定305nm下的吸光度值，并依據(jù)制霉菌素標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程計(jì)算制霉菌素的量，以大環(huán)糊精的濃度為橫坐標(biāo)，制霉菌素的濃度為縱坐標(biāo)繪制曲線，即為相溶解度圖。對(duì)曲線進(jìn)行回歸，則回歸方程的最高次冪即為大環(huán)糊精對(duì)制霉菌素的包埋比。

1.5 包合常數(shù)的測(cè)定

環(huán)糊精（CD）在水溶液中包合物的形成是一個(gè)平衡過(guò)程，符合質(zhì)量作用定律。當(dāng)形成1∶1包合物時(shí)，可以用下列通式表征這一過(guò)程：

則反應(yīng)平衡常數(shù)可以按照式（1）計(jì)算：

式中，K11為包合常數(shù)；[SL]為平衡時(shí)生成包合物的濃度，一般以物質(zhì)的量濃度表示；[S]、[L]則分別表示平衡時(shí)游離的底物與客體的濃度。

報(bào)道指出[9]，利用相溶解度圖的起始線性階段，可以計(jì)算包合物組成1∶1的穩(wěn)定常數(shù)見(jiàn)式（2）：

1.6 環(huán)糊精-制霉菌素包合物的制備

依據(jù)袁超等的報(bào)道[10]，稱取200mg的α-CD、β-CD、γ-CD以及LR-CD，溶于10m L的50%乙醇溶液中，加入2mg的制霉菌素，將該混合物置于棕色試劑瓶中，超聲處理5m in，吹氮以趕走試劑瓶中的空氣，馬上蓋上試劑瓶蓋，于35℃的振蕩水浴中100r/m in振蕩48h，真空干燥，將所得粉末用無(wú)水乙醇洗滌3次，干燥所得產(chǎn)品即為大環(huán)糊精-制霉菌素包合物。

1.7 復(fù)合物的紅外光譜鑒定

分別取適量的制霉菌素及制霉菌素的α-CD、β-CD、γ-CD、LR-CD包合物，分別與六倍質(zhì)量的KBr混勻，制作壓片，進(jìn)行500～4000cm-1的紅外光譜掃描。

1.8 數(shù)據(jù)處理

采用Orign軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，所有數(shù)據(jù)均為三次重復(fù)所求平均值，采用單因素方差分析統(tǒng)計(jì)學(xué)計(jì)算差異的顯著性，顯著水平為0.05。

2 結(jié)果與討論

2.1 制霉菌素紫外掃描圖譜

制霉菌素是一類大環(huán)內(nèi)酯，在其結(jié)構(gòu)中，在環(huán)的一邊是疏水性的共軛雙鍵結(jié)構(gòu)，另一側(cè)是羥基、羧基、胺等親水性基團(tuán)，制霉菌素的紫外吸收光譜如圖1所示。

圖1 不同濃度制霉菌素的紫外吸收光譜圖Fig.1 The absorption curve of nystatin with various contents

由圖1可以看出，制霉菌素在295、305、320nm處具有三個(gè)特征吸收峰，且在232nm處具有較寬的弱吸收。根據(jù)電子能級(jí)躍遷理論[11]，推測(cè)232nm處的弱吸收為π-π*躍遷造成的共軛二烯K帶吸收，295nm為n-σ*躍遷造成的羰基R帶吸收，305nm為π-π*躍遷造成的共軛四烯K帶吸收，320nm為四烯環(huán)的特征吸收。

2.2 包埋時(shí)間的確定

為確定合適的包埋條件，研究了制霉菌素的含量隨包埋時(shí)間變化，結(jié)果如圖2所示。

圖2 制霉菌素的包埋時(shí)間曲線圖Fig.2 Inclusion time for nystatin

從圖2可以看出，在包埋的最初階段，隨著包埋時(shí)間的延長(zhǎng)，包合物中制霉菌素的含量呈線性增加，但當(dāng)包埋時(shí)間超過(guò)20h時(shí)，制霉菌素的含量基本維持在恒定水平，當(dāng)包埋時(shí)間達(dá)到72h時(shí)，制霉菌素的含量有所下降。為了更好的保持實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性，選擇48h作為包埋時(shí)間。

2.3 相溶解圖

圖3 各環(huán)糊精相溶解曲線Fig.3 Phase solubility curves for various CD

根據(jù)LR-CD包結(jié)物的相溶解等溫線，將CD包合物分為五種類型：AP、AL、AN、BS、BI[9]。AP類型指包合物中客體的含量隨CD濃度的增加呈指數(shù)增加趨勢(shì)；AL類型指包合物中客體的含量隨CD濃度的增加呈線性增加趨勢(shì)，表明形成1∶1的包合物；AN類型指包合物中客體的含量隨CD濃度的增加呈對(duì)數(shù)增加趨勢(shì)；對(duì)于BS類型，客體的溶解度先隨CD濃度的增大而增大，隨后在某一CD濃度范圍內(nèi)維持在某一固定的值，當(dāng)所有客體全部轉(zhuǎn)化成包結(jié)物時(shí)，進(jìn)一步加LR-CD的量，反而使客體物質(zhì)結(jié)晶，減小其溶解度；BI類型表明形成的包結(jié)物不溶，客體分子的溶解度不變，直到全部形成包結(jié)物后，溶解度開(kāi)始下降。

依照實(shí)驗(yàn)方法，計(jì)算出制霉菌素在CD水溶液中的溶解度。以CD的濃度為橫坐標(biāo)，藥物溶解度為縱坐標(biāo)，繪制相溶解度曲線，如圖3所示。

從圖3可以看出，CD對(duì)制霉菌素有明顯增溶效果，且溶解度隨CD濃度增大而線性增加，根據(jù)Higuchi的報(bào)道[12]，β-CD、γ-CD以及LR-CD的相溶解曲線歸屬AL型，說(shuō)明這三種CD和制霉菌素形成的都是1∶1的包合物，而α-CD的相溶解曲線屬于BS型，可以推斷，α-CD分子較小的空腔結(jié)構(gòu)不適于制霉菌素客體分子進(jìn)入，而β-CD、γ-CD及LR-CD均可以和制霉菌素形成穩(wěn)定的包合物。

2.4 包合常數(shù)的計(jì)算

對(duì)圖3中的曲線求斜率，計(jì)算包合常數(shù)，結(jié)果如表1所示。

表1 各環(huán)糊精包合常數(shù)Table1 Inclusion constants for various cyclodextrins

由表1可以看出，LR-CD的包合常數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于α-CD及β-CD，表明LR-CD對(duì)于包埋分子量較大的大環(huán)內(nèi)酯類物質(zhì)具有更高的優(yōu)勢(shì)。

2.5 增溶常數(shù)和增溶倍數(shù)的預(yù)測(cè)

根據(jù)參考資料提供的CD在水中的最大溶解度[13]，根據(jù)圖3的相溶解度圖，對(duì)其進(jìn)行線性回歸，按照1∶1的包埋比對(duì)制霉菌素的最大溶解度進(jìn)行預(yù)測(cè)，則飽和LR-CD溶液對(duì)制霉菌素的增溶倍數(shù)達(dá)到2958.87倍，這為制霉菌素由外敷使用為主拓展為注射用針劑提供了可能，對(duì)于擴(kuò)大制霉菌素等大環(huán)內(nèi)酯類抗生素的應(yīng)用范圍提供了有價(jià)值的參考。

2.6 包合物的鑒定

為進(jìn)一步研究大環(huán)糊精對(duì)制霉菌素的包埋特點(diǎn)，本文以常見(jiàn)環(huán)糊精-制霉菌素包合物作為對(duì)照，進(jìn)行了四種包合物的紅外光譜鑒定，結(jié)果如圖4所示。

制霉菌素（a）的紅外光譜圖中，3415cm-1為-OH伸縮振動(dòng)，3024cm-1為N-H的伸縮振動(dòng)，2851cm-1為亞甲基的C-H伸縮振動(dòng)，1723cm-1為C=O伸縮振動(dòng)，1630cm-1為共軛雙鍵的伸縮振動(dòng)，1449、1381cm-1為甲基中C-H彎曲振動(dòng)，963cm-1為共軛鍵中C-H的彎曲振動(dòng)。對(duì)比a、c、d、e的紅外吸收?qǐng)D譜發(fā)現(xiàn)，3024cm-1處的吸收峰隱沒(méi)，1723cm-1處的吸收峰強(qiáng)度變小，1449、1381cm-1處吸收峰隱沒(méi)，2851、1630cm-1處的吸收峰向高波數(shù)方向發(fā)生位移；此外，對(duì)比b的紅外光譜與c、d、e的紅外光譜圖，發(fā)現(xiàn)1723cm-1處的吸收峰隱沒(méi)，說(shuō)明制霉菌素的酯鍵進(jìn)入到α-CD空腔，而共軛四烯部分未進(jìn)入CD空腔；此外，制霉菌素的羧基及氨基可能與CD表面的羥基以氫鍵的方式發(fā)生作用，對(duì)于維持穩(wěn)定的復(fù)合物構(gòu)象起到重要作用。

圖4 包合物的紅外圖譜Fig.4 FTIR of complexes

3 結(jié)論

LR-CD對(duì)制霉菌素的相溶解曲線歸屬AL型，表明大環(huán)糊精與制霉菌素的包埋比為1∶1；計(jì)算得到LR-CD包埋制霉菌素的包合常數(shù)為1.577L/mmol，遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于β-環(huán)糊精和γ-環(huán)糊精對(duì)制霉菌素的包埋常數(shù)（0.375L/mmol和0.539L/mmol）；預(yù)測(cè)得到飽和LR-CD溶液對(duì)制霉菌素的增溶倍數(shù)為2958.87倍；IR分析表明制霉菌素的酯鍵部分進(jìn)入到CD的空腔，而共軛四烯部分及羧基、氨基部分在CD腔體表面。本研究對(duì)于提高制霉菌素的溶解度、擴(kuò)大制霉菌素的應(yīng)用范圍以及擴(kuò)大大環(huán)糊精的應(yīng)用范圍提供了有益參考。

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