黃俊喜，鄒文姝，曾火才，曾 燕，曾林源

(廣東省河源市和平康平醫(yī)院急診科，廣東 河源 517200)

80%心血管疾病的終末階段都會出現(xiàn)慢性心力衰竭癥狀［1］，主要表現(xiàn)為肺循環(huán)和體循環(huán)出現(xiàn)淤血特征。對慢性心力衰竭病癥的診斷難度較大，主要是針對輕、中度慢性心力衰竭患者的初期診斷及治療策略設(shè)定能夠顯著改善患者的預(yù)后。慢性心力衰竭(CHF)發(fā)病與神經(jīng)激素異常激活、炎性細(xì)胞因子如TNF－α等有緊密的關(guān)系［2］。盡管如此，近來研究發(fā)現(xiàn)，在慢性心力衰竭(CHF)患者血清中非對稱性二甲基精氨酸能夠抑制一氧化氮合酶的生成［3］，進(jìn)而影響一氧化氮(NO)的生成，而且從基因水平也得到了一致性結(jié)果，這一機(jī)制可能是慢性心力衰竭發(fā)病的一個產(chǎn)生原因，本研究探討血清非對稱性二甲基精氨酸濃度在慢性心力衰竭患者發(fā)病過程中的作用機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 一般資料:隨機(jī)選擇2008年2月至2010年12月在我院住院慢性心力衰竭患者70例，男37例，女33例，年齡55－65歲，平均(60.23±2.13)歲，于入院當(dāng)天進(jìn)行超聲心動圖檢查，并記錄左室舒張末期內(nèi)徑(LVEDD)和左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)按紐約心臟學(xué)會(NYHA)標(biāo)準(zhǔn)心功能分級為Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ級，其中Ⅱ級22例，Ⅲ級25例，Ⅳ級23例。所有研究對象均排除急慢性感染、肝腎功能不全、嚴(yán)重的電解質(zhì)紊亂、自身免疫性疾病、糖尿病、惡性腫瘤、應(yīng)用類固醇治療者和半年內(nèi)有過急性心肌梗死者。另外，選擇同時期經(jīng)過體檢健康者70例，男36例，女34例，年齡55－65歲，平均(60.45±2.37)歲。兩組比較差異具有可比性，無統(tǒng)計學(xué)意義。

1.2 方 法

1.2.1 檢測指標(biāo)及方法:兩組受試者入院后空腹10－13h，在仰臥姿勢條件，靜息狀態(tài)下抽取2mL肘靜脈血［9］，采用抗凝管裝存，血漿分離后－70℃保存，采用ELISA法在酶標(biāo)儀上測定血清非對稱性二甲基精氨酸的含量。采用硝酸還原酶比色法(南京建成生物工程研究所檢測血清中NO的含量。采用彩色多普勒超聲診斷儀(美國ACUSIONl28 XWIO型)變頻探頭2.0－3.5MHz。左心室參數(shù)測定包括舒張末內(nèi)徑(LVEDD)、左心室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)。

1.2.2 RNA 提取:1000rpm/min離心細(xì)胞收取，轉(zhuǎn)至1.7mL離心管，加入 1mL Trizol溶液，加入 0.2mL氯仿。Vortex混勻，5min室溫靜置，然后11000rmp離心，時間為15min。將上層的水相轉(zhuǎn)入到1.5mL EP管，添加等體積異丙醇，Vortex混勻，然后置于－20℃冰箱中，過30min后，11000rmp離心10min。小心把上清倒掉，保留沉淀。添加1mL 75%的乙醇，然后洗滌RNA沉淀，最后7000rmp離心6min。棄上清，靜置5min。

1.2.3 RT－PCR:NanoDrop定量后按照 TOYOBO 的RT－PCR試劑盒說明書進(jìn)行。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)條件:37℃25min(RT－PCR反應(yīng))85℃ 5sec(酶失活反應(yīng))。

1.2.4 實時熒光定量Q－PCR:用 Primer Premier 5.0的軟件設(shè)計、并合成了相關(guān)基因引物，上海博尚生物技術(shù)有限公司合成引物，其特異性利用融解曲線進(jìn)行分析驗證。cDNA表達(dá)豐度采用Ct值進(jìn)行檢測，β－actin的Ct值作為內(nèi)參。反轉(zhuǎn)錄結(jié)束之后，利用SYBR Green(Toyobo)按說明書進(jìn)行熒光定量PCR。三步法進(jìn)行Q－PCR擴(kuò)增反應(yīng)條件如下:

95℃10sec 1 cycle

95℃15sec

60℃20sec 45 Cycles

72℃35sec

Dissociation stage

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理:采用SPSS 12.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以±s表示，多組間數(shù)據(jù)采用方差分析。

2 結(jié)果

表1 各組血清非對稱性二甲基精氨酸水平(pg/mL)及左心室超聲心動圖各參數(shù)比較

2.1 不同組間血清非對稱性二甲基精氨酸水平及左 心室參數(shù)比較:不同心功能級別的慢性心力衰竭患者相比于對照組血清非對稱性二甲基精氨酸水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其中，ADMA隨著心功能級別的升高，含量也隨之增加。LVEDD沒有規(guī)律性變化趨勢，但是LVEF在患病組要低于對照組，同時與心功能級別呈負(fù)相關(guān)，見表1。

2.2 不同組間血清NO及NOS的含量比較:不同心功能級別的慢性心力衰竭患者相比于對照組血清NO及NOS水平比較，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。其中，NO及NOS在對照組中的含量高于患病組，而且在患病組中與心功能級別呈負(fù)相關(guān)。

表2 各組血清NO(pg/mL)及NOS的含量比較

2.3 不同心功能級別DDAH及NOS基因的表達(dá)水平:DDAH能夠分解代謝機(jī)體內(nèi)五分之四的非對稱性二甲基精氨酸(ADMA)，使其排出體外，而NOS負(fù)責(zé)催化L－精氨酸生成NO。這兩個基因在慢性心力衰竭發(fā)病中或許起到了關(guān)鍵性的作用。我們通過熒光定量PCR檢測了DDAH－1，DDAH－2，NOS基因在對照組及患病組中的表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，DDAH－2在不同組間無明顯變化，但是DDAH－1及NOS的基因表達(dá)水平的患病組高于低于對照組，同時其表達(dá)水平與心功能級別呈負(fù)相關(guān)。(如圖1)。

圖1 不同心功能級別DDAH及NOS基因的表達(dá)水平

3 討論

Vallance和他的研究團(tuán)隊在1992年報道ADMA是一氧化氮合酶的天然抑制劑［4］。ADMA能夠抑制NO的產(chǎn)生，進(jìn)而導(dǎo)致內(nèi)皮功能紊亂及心血管疾病。動脈粥樣硬化，慢性心力衰竭等疾病在研究領(lǐng)域的廣泛關(guān)注也逐漸揭開了血清ADMA這一心血管風(fēng)險因子的面紗。

從病理角度分析，慢性心力衰竭患者血清中ADMA水平逐漸升高。首先，ADMA能夠通過抑制NO產(chǎn)生進(jìn)行加劇慢性心力衰竭癥患病，具體來說，NO的含量下降能夠?qū)е聝?nèi)皮功能紊亂［5］，而內(nèi)皮功能紊亂與慢性心力衰竭緊密相關(guān)，這一紊亂狀態(tài)無法被機(jī)體保護(hù)性分子如神經(jīng)激素類因子所改善。其次，ADMA的初期體內(nèi)累積能夠抑制二甲基精氨酸的活性［6］，二甲基精氨酸是ADMA的主要降解途徑。而二甲基精氨酸的活性受抑制機(jī)理是由于高度的氧化造成的，而且慢性心力衰竭的癥狀加劇也與過度氧化離不開［7］。

近來研究顯示，血液中高濃度的ADMA被發(fā)現(xiàn)與慢性心力衰竭病癥有緊密聯(lián)系。這一發(fā)現(xiàn)也提示我們是否ADMA能夠作為慢性心力衰竭的診斷指標(biāo)。也有研究顯示，ADMA伴隨慢性心力衰竭的高濃度特征可能是由于代償性機(jī)能減退的原因。為了解決這一難題，我們試圖從分子水平進(jìn)行研究，選擇了DDAH基因，DDAH負(fù)責(zé)分解代謝機(jī)體內(nèi)五分之四的ADMA［8］，解除其對一氧化氮合酶的抑制作用，DDAH有兩個亞型，DDAH－1和DDAH－2，經(jīng)過熒光定量PCR檢測健康對照組和患病組中的DDAH基因表達(dá)水平，結(jié)果顯示，盡管DDAH－2基因表達(dá)水平基本沒有變化，但DDAH－2有顯著的下調(diào)趨勢。同時NOS也與其趨勢相一致。

［1］ 胡春松，魏云峰.心力衰竭患者血清CA125，CA199水平變化及意義［J］.中國分子心臟病學(xué)雜志，2005，5(1):415－517.

［2］ 李澤堅.實用臨床胸外科學(xué)［M］.北京:科學(xué)技術(shù)文獻(xiàn)出版社，2007.424－425.

［3］ 石丹，董少紅，高虹，等.充血性心力衰竭患者CA125與EF的關(guān)系［J］.暨南大學(xué)醫(yī)學(xué)報(自然科學(xué)與醫(yī)學(xué)版)，2002，23(2):97－99.

［4］ 陳倩，李小鷹，李江源.老年男性心力衰竭患者性激素水平調(diào)查及與同齡健康男性的比較［J］.中華心血管病雜志，2005，33:505－508.

［5］ Adams K，Sueta C，Mihar G.Gender differences in survival in advanced heart failure:insights from the first study［J］.Circulation，1999，99:1816－1821.

［6］ Koenig HG.Depression in hospitalized older patients with congestive heart failure［J］.Gen Hosp Psychiatry，1998，20:29－ 43.

［7］ Guck T，Elsasser G，KAvan M，et al.Depression and conges-tion heart failure［J］.Congestive Heart Fail，2003，9:163－169.

［8］ Tsay SL，Chao YF.Effects of perceived self－efficacy and functional status on depression with chronic heart failure［J］.Nurs Res，2002，10(4):271－278.