武承興 王 健 張波 鄭 丹 寧余力

黃芪對自體脂肪顆粒移植存活率的影響

武承興 王 健 張波 鄭 丹 寧余力

目的探討黃芪對自體脂肪顆粒移植成活率的影響。方法建立新西蘭大白兔自體脂肪移植動物模型，設(shè)立實驗組和對照組，實驗組予以肌肉注射不同劑量的黃芪注射液。檢測血液中VEGF含量，脂肪移植體剩余重量，計算移植脂肪的存活率；HE染色后鏡下觀察脂肪移植組織細胞形態(tài)和血管密度；血管內(nèi)皮細胞Ⅷ因子免疫組化法觀察新生血管生長情況及密度。結(jié)果實驗組移植脂肪組織存活率明顯高于對照組；實驗組血清VEGF表達水平明顯高于對照組；HE染色及血管內(nèi)皮細胞Ⅷ因子免疫組織化學(xué)染色顯示實驗組在脂肪細胞數(shù)量、形態(tài)、脂肪移植體纖維化程度及新生毛細血管密度等方面均優(yōu)于對照組。結(jié)論黃芪注射液能夠顯著提高新西蘭大白兔自體脂肪顆粒移植的存活率。

黃芪自體脂肪移植血管內(nèi)皮細胞生長因子存活率

軟組織缺損造成的臨床先天或后天性畸形的發(fā)病率逐年上升，整復(fù)外科應(yīng)用各種方法，通過組織的移植、充填修復(fù)軟組織缺損[1-5]。自體脂肪組織作為理想的軟組織充填材料，來源豐富、易于獲取、供區(qū)損傷小，但長期存活率卻無法預(yù)測[6]。近年來，很多研究都關(guān)注于提高自體游離脂肪的移植存活率[6-12]。研究表明，血運重建對于顆粒脂肪移植存活率有重要意義，提高脂肪移植存活率的關(guān)鍵是改善血液循環(huán)，盡快重建游離脂肪的血運[11-12]。

黃芪是最常用的益氣中藥，黃芪對促進缺血區(qū)血管新生的相關(guān)研究認為，黃芪可明顯上調(diào)VEGF水平，促進血管內(nèi)皮細胞增殖及DNA合成[13-15]。于是我們設(shè)想，是否可以使用黃芪注射液促進移植脂肪組織新生血管的形成，提高脂肪顆粒移植物的存活率？本實驗建立新西蘭大白兔自體脂肪移植動物模型，觀察黃芪注射液對脂肪移植體血運重建、新生毛細血管變化、脂肪顆粒移植物成活率的影響，為臨床提高脂肪移植成活率提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑、材料

黃芪注射液（正大青春寶藥業(yè)有限公司）；VEGF的ELISA試劑盒（R&D公司）；兔多克隆血管內(nèi)皮細胞Ⅷ因子抗體（Biorbyt公司）；鼠兔通用免疫組化二抗（Dako公司）；免疫組化抗體稀釋液（Dako公司）；磷酸鹽緩沖液、鹽酸氯胺酮注射液、陸眠寧Ⅱ注射液（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物實驗中心提供）

1.2 實驗方法

1.2.1 實驗動物及其分組情況

健康新西蘭大白兔15只（上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院動物實驗中心提供），雌雄不限，體質(zhì)量約2.5～3.0 Kg，隨機分成3組：對照組5只（單純自體脂肪移植）；實驗1組5只（自體脂肪移植+肌肉注射黃芪注射液2.5 g/Kg.d）；實驗2組5只（自體脂肪移植+肌肉注射黃芪注射液5 g/Kg.d），均持續(xù)用藥2周。

1.2.2 自體脂肪顆粒移植動物模型的建立

動物術(shù)前禁食12 h，鹽酸氯胺酮注射液0.10 mL/Kg及陸眠寧Ⅱ注射液0.20 mL/Kg肌肉注射麻醉。刮除單側(cè)腹股溝及雙耳背部皮毛，固定，消毒，鋪巾，于腹股溝上1.5 cm處斜行切口，長約3 cm，切開皮膚全層暴露腹股溝脂肪墊（圖1），取出脂肪總量約2.5 mL，立即轉(zhuǎn)移到PBS溶液中，徹底沖洗，剪碎，獲得直徑1～2 mm的脂肪顆粒。消毒耳背部皮膚，將脂肪顆粒吸入2 mL注射器內(nèi)，以8號注射針頭分別注入雙耳背部皮下共4個部位，每次0.5 mL（圖2）。

圖1 暴露腹股溝脂肪組織并游離Fig.1The fat tissue in the groin area was exposed and dissociated

圖2 移植脂肪組織注射入兔耳背部皮下Fig.2The autologous fat particle were injected into thesubcutaneous area of the rabbit

1.2.3 標(biāo)本采集

分別于術(shù)后1周、2周、4周、6周、8周耳緣靜脈取血，每只取血1 mL，離心后取上層血清，-80℃冰箱保存，酶聯(lián)免疫吸附法（ELISA）檢測血清VEGF表達水平。術(shù)后3月進行脂肪移植體標(biāo)本取材，于脂肪移植體外周1 cm處切開皮膚，沿被膜仔細分離，完整取下脂肪移植體，分離，修去周圍組織及包膜，準(zhǔn)確秤重，與術(shù)前記錄對比得到移植存活率。然后4%多聚甲醛固定24 h，石蠟包埋切片，行HE染色及血管內(nèi)皮細胞Ⅷ因子免疫組化染色。

1.2.4 統(tǒng)計學(xué)分析

使用SPSS13.0軟件進行處理，所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗或單因素方差分析進行檢驗，存活率比較采用卡方檢驗，雙側(cè)檢驗水準(zhǔn)為α=0.05，P＜0.05認為差異有顯著性意義。

2 結(jié)果

2.1 自體脂肪移植組織大體觀察

自體脂肪移植術(shù)后90 d取材，大體觀察可見實驗組脂肪組織移植體體積均大于對照組，其中實驗組2體積最大（圖3）。

圖3 自體脂肪移植術(shù)后90天各組脂肪組織移植體體積對比Fig.3The volume comparison of fat grafts in each group 90 days after autologous fat transplantation

2.2 各組脂肪移植體存活率比較

術(shù)后90 d，對照組脂肪移植存活率（43.6±5.5）%，實驗組1脂肪移植存活率（61.9±7.2）%，實驗組2脂肪移植存活率（63.5±7.3）%。實驗組脂肪組織移植存活率均明顯高于對照組，具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；實驗組1與實驗組2脂肪組織移植存活率無統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05）（圖4）。

圖4 各組間脂肪移植體存活率比較Fig.4The survival rates of fat grafts among each group

2.3自體脂肪顆粒移植各組間血清VEGF表達

實驗組1與實驗組2的血清VEGF表達水平在移植術(shù)后1周、2周、4周和6周時，均比對照組明顯增高（P＜0.05），在術(shù)后2周時達到高峰。實驗組1與實驗組2血清VEGF表達水平無顯著差異（P＞0.05）（圖5）。

圖5 各組血清VEGF表達Fig.5The VEGF concentration of blood serum among each group

2.4 組織學(xué)觀察

HE染色顯示，對照組移植脂肪組織中有較多脂肪細胞壞死融合，形成了大小不等的空泡，存活脂肪細胞大小不規(guī)則，分布不均勻，呈島狀散布在脂肪移植體中，偶見慢性炎性反應(yīng)，纖維結(jié)締組織較多，并有分隔傾向，血運不豐富，新生血管不明顯。實驗組1和實驗組2均可見脂肪細胞增生，組織纖維間隔不多，脂肪小葉以及脂肪小葉間纖維組織保持較好，周圍血管較豐富，新生脂肪細胞排列比較整齊，形態(tài)規(guī)則。實驗組2對比實驗組1的移植體中心區(qū)細胞分布更均勻，移植體周邊區(qū)血管較豐富，纖維結(jié)締組織較少，但以上差別不明顯（圖6）。

2.5 血管內(nèi)皮細胞Ⅷ因子免疫組化染色

免疫組化染色顯示，血管呈現(xiàn)棕黃色，部分毛細血管形態(tài)不規(guī)則，管腔由被染棕黃色的血管內(nèi)皮細胞圍成，部分微血管未見明顯管腔，呈條索狀或者島狀，部分只見到單個血管內(nèi)皮細胞或成團簇狀內(nèi)皮細胞團。對照組移植脂肪組織血運不豐富，新生血管不明顯。實驗組1和實驗組2自體脂肪移植90 d后移植體周邊區(qū)和中心區(qū)血管均較豐富，但差別不明顯（圖7）。

2.6 毛細血管密度評估

對照組移植脂肪組織的毛細血管密度為（14.10±2.83）條/HP，實驗組1為（24.85±3.27）條/HP，實驗組2為（25.76±3.42）條/HP。實驗組1與實驗組2毛細血管密度均明顯高于對照組（P＜0.05）；實驗組1、2的毛細血管密度無明顯差異（P＞0.05）（圖8）。

圖6 各組HE染色結(jié)果Fig.6Histological observation in each group by HE staining

圖7 血管內(nèi)皮細胞Ⅷ因子免疫組化染色結(jié)果(100×)Fig.7The samples were stained with factorⅧimmunohistochemistry method(100×)

圖8 各組新生血管密度Fig.8Vessel number in each group

3 討論

自體脂肪移植修復(fù)軟組織缺損是傳統(tǒng)方法，具有來源豐富、取材簡便、組織相容性好，無排異過敏反應(yīng)等優(yōu)點。但自體脂肪移植存活率較低，一直是自體脂肪移植廣泛應(yīng)用的最大障礙。

研究認為，加快脂肪移植組織的血供重建是提高脂肪顆粒移植存活率的關(guān)鍵因素。CM-Dil標(biāo)記的血管內(nèi)皮前體細胞復(fù)合游離脂肪移植，顯示了較高的脂肪存活率和新生毛細血管密度[11-12]。Langer等[16]利用活體免疫熒光顯微鏡進行觀察，發(fā)現(xiàn)脂肪組織移植后的血供依賴周圍血管的長入。杜學(xué)亮等[17]證明，新生血管的生長快慢對脂肪移植體尤為重要，移植體與受體建立良好的血運是脂肪移植組織存活的關(guān)鍵。血管內(nèi)皮生長因子是最早發(fā)現(xiàn)的促血管生長因子，也是目前發(fā)現(xiàn)的最強效的促血管生成因子，在血管形成過程中發(fā)揮重要作用，局部的血管內(nèi)皮生長因子（VEGF）能提高游離移植脂肪的存活率和質(zhì)量[6-10]。Lei等[18]在SD大鼠自體顆粒脂肪移植的部位注射含有編碼重組人血管內(nèi)皮生長因子（rhVEGF）DNA的脂質(zhì)體質(zhì)粒，結(jié)果顯示rhVEGF試驗組的微血管計數(shù)遠遠高于對照組，脂肪移植體吸收率較低。

近年來，隨著中藥研究的深入開展，許多中藥的藥理功效得到了廣泛認同。黃芪是最常用的益氣中藥之一，具有補氣升陽、益衛(wèi)固表、托毒生肌、利水消腫之功。據(jù)李時珍的《本草綱目》記載，黃芪的諸多功效皆源于其補氣功能，故又有“補氣諸藥之最”之稱。氣為血之帥，氣旺則血行，臨床治療氣虛血瘀的病癥，常配伍使用黃芪，通過益氣而達活血之效。眾多針對黃芪促進缺血區(qū)血管新生的相關(guān)研究認為，黃芪可明顯上調(diào)VEGF水平，有促進血管內(nèi)皮細胞增殖及DNA合成的作用[13-14]。雷燕等[13]應(yīng)用雞胚絨毛尿囊膜（Chorioallantoic membrance，CAM）模型和中藥血清藥理學(xué)方法，以CAM血管生成數(shù)量為指標(biāo)觀察黃芪對血管生成的影響，結(jié)果表明黃芪給藥組比生理鹽水對照組血管密集度增加，給藥組在血管生成表現(xiàn)形式及血管計數(shù)方面均好于對照組，表明黃芪對血管生成有促進作用。李悅山等[15]研究同樣認為黃芪有促進內(nèi)皮細胞增殖和VEGF表達的作用?；谏鲜鼋Y(jié)果，本實驗將黃芪應(yīng)用在提高自體脂肪顆粒移植存活率的研究中，希望了解黃芪對自體脂肪移植組織存活率、血管新生、血運重建等的影響。

結(jié)果顯示，在自體脂肪顆粒移植術(shù)后90 d，兩實驗組自體脂肪顆粒移植存活率均明顯高于對照組，提示通過體內(nèi)注射黃芪注射液有助于提高自體脂肪移植成活率。血清中VEGF表達水平檢測結(jié)果顯示，實驗組1、2的血清VEGF在脂肪移植術(shù)后的不同時間段的表達水平均比對照組有明顯增高。實驗中，實驗組1、2的血清VEGF濃度在術(shù)后2周達最高峰，隨后逐漸下降，至術(shù)后6周仍與對照組有顯著差異。提示黃芪具有持續(xù)的生物學(xué)效應(yīng)，可維持6周的生物學(xué)效應(yīng)，對移植脂肪存活率的提高至關(guān)重要。實驗組1與實驗組2的血清VEGF表達水平略有差異，但不明顯。表明黃芪注射液在2.5 g/Kg.d的劑量下，已經(jīng)能達到促進VEGF表達，提高脂肪移植存活率的作用。

本實驗在脂肪移植術(shù)后90 d進行取材，此時移植脂肪組織的重量、體積以及組織結(jié)構(gòu)基本保持穩(wěn)定，HE切片染色及免疫組化染色觀察顯示在脂肪細胞大小、形態(tài)、壞死吸收情況、移植脂肪組織纖維化程度、新生毛細血管數(shù)量、密度等方面，實驗組均優(yōu)于對照組。結(jié)合自體脂肪移植術(shù)后脂肪移植組織的重量變化，以及血清內(nèi)皮細胞生長因子的表達程度，我們認為黃芪可能在自體脂肪組織移植后通過加快移植體內(nèi)部血供的重建，有效促進血管新生，改善組織血供及微循環(huán)，縮短自體脂肪移植組織的缺血、缺氧期，從而減輕脂肪移植組織壞死，減少組織纖維化，提高自體脂肪移植成活率。

但是，黃芪能否通過前脂肪細胞的轉(zhuǎn)化，更好地提高自體脂肪組織移植的存活率，以及黃芪與其他中藥如當(dāng)歸、丹參等的組合應(yīng)用是否更有利于提高自體脂肪移植的存活率，尚待深入研究。

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（收稿日期：2013年3月20日；修回日期：2013年5月8日）

Influence of Astragalus on the Survival Rate of Fat Particle Auto-Transplantation

WU Chengxing,WANG Jian,

ZHANG Bo,ZHENG Danning,YU Li.Department of Plastic and Reconstructive Surgery,Shanghai Ninth People's Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine,Shanghai 200011,China.Corresponding author:YU Li(E-mail:yuoli@163. com).

ObjectiveTo explore the influence of astragalus on the survival rate of fat particle auto-transplantation. MethodsAutologous fat particle was transferred on New Zealand white rabbit to establish an animal model.The experimental groups were given different doses of astragalus by intramuscular injection.The expression level of VEGF in serum were assayed,the residual quality of the fat grafts were measured and the survival rates were calculated.After HE staining,adipocyte morphology and density of blood vessels was observed.Immunohistochemical staining of vascular endothelial cells factorⅧwere used to observe the capillary growth and density.ResultsThe survival rate of fat transplantation in experimental groups was higher than that in control group.The level of VEGF expression in experimental groups was higher than that in control group.HE staining and immunohistochemical staining of vascular endothelial cells factorⅧshowed the number,the shape,the degree of the fat transplantation fibrosis and the newborn microvessle density were better in experimental groups than that in control group.ConclusionAstragalus can significantly promote the survival rate of autologous fat particle transplantation in the model of New Zealand white rabbit.

Autologous fat transplantation;Astragalus;Vascular endothelial growth factor;Survival rate

R622+.9

A

1673－0364（2013）03－0141－05

2013年3月8日；

2013年4月20日

200011上海市上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬第九人民醫(yī)院整復(fù)外科。

余力（E-mail：youli@163.com）。

10.3969/j.issn.1673-0364.2013.03.006