吳則東，徐艷麗，王華忠

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學(xué),哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院,哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室,哈爾濱150080；4.新疆博樂市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,博樂833400）

新型核酸染料在甜菜分子實驗瓊脂糖電泳中的應(yīng)用

吳則東1,2,3，徐艷麗4，王華忠1,2,3

（1.黑龍江省普通高等學(xué)校甜菜遺傳育種重點實驗室/黑龍江大學(xué),哈爾濱150080；2.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院甜菜研究所/黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院,哈爾濱150080；3.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北方糖料作物資源與利用重點開放實驗室,哈爾濱150080；4.新疆博樂市農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣中心,博樂833400）

通過對兩種核酸染料Goldview（GV）和EB(溴化乙錠)對甜菜基因組DNA及Lambda DNA的染色效果進(jìn)行比較研究，發(fā)現(xiàn)兩種染料染色效果相當(dāng)，清晰度相差不大，均可有效鑒別20ng以上的DNA樣品，證實新型核酸染料Goldview完全可以代替強(qiáng)毒性的EB，用于甜菜基因組以及某些PCR產(chǎn)物的檢測。

甜菜基因組；溴化乙錠；Goldview

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,很多相關(guān)的實驗室每天都在進(jìn)行著DNA提取以及檢測的工作,而核酸染料則是不可缺少的試劑。目前大多數(shù)實驗室所使用的核酸染料都是EB。EB具有操作快速,在低濃度的條件下,在紫外光下至少可以檢出1～10ng的DNA條帶,從而可以確定凝膠中DNA片段的位置[1]。雖然EB具有以上很多優(yōu)點,目前仍是國內(nèi)大多數(shù)實驗室首選的藥品,但EB具有致癌作用,操作時要戴上手套,操作不當(dāng)極易造成傷害及對環(huán)境的污染[2]。近年來,有多種EB的替代品問世,例如SYBR Green I[3-4]就是一種高靈敏度且不具有強(qiáng)致突變性的核酸染料,國外一些實驗室已經(jīng)在使用,國內(nèi)也有些實驗室利用SYBR Green I取代EB,可以檢測出20pg的DNA,比EB靈敏20～100倍,但其價格過于昂貴,對于實驗室每天都要用到的必需品,很多實驗室難以承受。因此我們選擇了一種價格便宜、使用方法與EB相同,且不具致癌性的新型核酸染料GV進(jìn)行實驗,驗證其在甜菜分子生物學(xué)實驗中代替EB的可能性。

1 材料和方法

1.1材料和試劑

1.1.1 實驗材料實驗中所用的甜菜品種為甜研310、ZD204、ZD210、內(nèi)28128和甜單305（分別編號為1、2、3、4、5）,所有品種由黑龍江大學(xué)農(nóng)作物研究院和內(nèi)蒙古農(nóng)牧業(yè)科學(xué)院提供。

1.1.2 實驗試劑GV染料、EB、瓊脂糖等購自哈爾濱晶美生物公司,Lambda DNA購自上海生工,其余試劑為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 主要儀器DYCZ-30型電泳槽（北京六一儀器廠）,伯樂公司的凝膠成像儀,伯樂的電泳儀,JY-SPA水平電泳槽,國產(chǎn)真空冷凍干燥機(jī)。

1.2實驗方法

1.2.1 DNA的提取采用SDS法[5]提取甜菜基因組DNA,略有改動,利用真空冷凍干燥機(jī)將3份甜菜材料的葉片轉(zhuǎn)化為干粉,每份干粉稱取30mg。加入SDS提取液,65℃水浴40min。冷卻至室溫后,13000r/min離心8min,取上清。加入等體積氯仿：異戊醇（24∶1）,混勻,13000r/min離心8min,取上清。加入等體積的異丙醇,混勻,12000r/min離心8min,去上清。用適量預(yù)冷70%乙醇清洗沉淀2次。將沉淀干燥后溶于200μL滅菌的雙蒸水,-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 1%瓊脂糖制備稱取0.5g瓊脂糖置于三角瓶內(nèi),加入50mL 0.5×TBE緩沖液,利用微波爐加熱使其溶化,輕輕混勻,冷卻至室溫,以手摸不燙為準(zhǔn),加入20000×GV染料2μL,輕輕混勻倒乳制膠槽。EB的瓊脂糖制備與此相同,只是50mL凝膠中加入10mg/mL的EB為5μL。

1.2.3 Lambda DNA及甜菜基因組檢測6μL體系中分別含有100ng、90ng、80ng和10ng的Lambda DNA及1μL的上樣緩沖液（0.25%的溴酚藍(lán)及40%的蔗糖）；6μL體系中含有2μL的甜菜基因組DNA,1μL的上樣緩沖液,3μL的雙蒸水。分別用含有EB及GV的1%瓊脂糖進(jìn)行檢測。

2 結(jié)果分析

2.1不同染料對不同濃度的Lambda DNA檢測

利用1%瓊脂糖電泳分別對不同濃度的Lambda DNA使用EB及GV進(jìn)行染色,檢測結(jié)果見圖1,從圖中我們可以看出,兩種染料均能夠辨別出10ng以上的DNA,其中10ng的Lambda DNA亮度均較弱。

2.2不同染料對甜菜基因組DNA的檢測

利用1%瓊脂糖電泳分別對5個不同的甜菜品種采用EB及GV進(jìn)行檢測,結(jié)果見圖1,從從中我們看出,兩者檢測的甜菜基因組DNA亮度差異不大,從圖中我們也可以看出只是顏色對比度不同,但不影響染色結(jié)果。

圖1 不同染料DNA瓊脂糖電泳效果

3 結(jié)論與討論

由于DNA的提取以及RAPD[6]、SSR[7]、ISSR[8]等很多分子標(biāo)記都要用到瓊脂糖凝膠電泳,利用凝膠成像系統(tǒng)進(jìn)行拍照,因此不可避免地要用到染料對DNA進(jìn)行定位,而目前廣泛使用的就是EB。由于EB的毒性較大,而且難于降解,凈化處理一般要采用KMnO4-HCl-NaOH和活性炭吸附-濾紙過濾等復(fù)雜方法[1]。而國內(nèi)很多的分子實驗室都采取集中回收,對EB等有毒實驗室廢物進(jìn)行集中處理。但仍有一部分實驗室把EB等有毒物質(zhì)直接按照生活垃圾處理,極大地污染了環(huán)境。由于EB具有受熱揮發(fā)以及難降解性,所以EB在使用過程中,如果不小心也會對實驗人員造成傷害。從本實驗的結(jié)果來看,GV的染色效果和EB相比較差異不大,均可對10ng以上的DNA進(jìn)行染色,靈敏度都很高,因此建議在甜菜分子生物學(xué)實驗中使用GV代替EB。

雖然GV具有很多優(yōu)點,但在使用中應(yīng)當(dāng)注意以下幾點：（1）GV的穩(wěn)定性不如EB,放在冰箱的保鮮層保存；（2）膠太厚會影響檢測的靈敏度,最好不超過5cm；（3）GV對緩沖液的要求較高,最好每次都更換緩沖液；（4）雖然GV沒有明顯的致癌性,但作為一種化學(xué)試劑,在使用中也要戴上手套,避免和皮膚直接接觸。

[1]薩姆布魯J,弗里奇EF,曼尼阿蒂斯T（黃培堂譯）.分子克隆實驗指南[M].北京：科學(xué)出版社,1998.

[2]崔成德,王克林,李涢,等.Genefinder和EB在DNA電泳譜帶定量分析中的比較[J].安徽農(nóng)業(yè)科學(xué),2008,36(2)：452-453.

[3]Simpson DAC,Feeney S,Boyle C,et al.Technical Brief：Retinal VEGF mRNA Measured by SYBR Green I Fluorescence：A Versatile Approach to Quantitative PCR[J].Mol Vis.,2000,6：178-183.

[4]Zipper H,Brunner H,Bernhagen J,et al.Investigations on DNA intercalation and surface binding by SYBR Green I,its structure determination and methodological implications[J].Nucleic acids research,2004,32(12)：e103.

[5]侯靜,馬鳳鳴,陳勝勇,等.甜菜基因組DNA的提取及Southern雜交分析[J].東北農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報,2008,39(12)：14-18.

[6]趙培,王振英,彭永康.瓊脂糖和聚丙烯酰胺凝膠電泳技術(shù)檢測小麥基因組DNA RAPD擴(kuò)增產(chǎn)物的方法學(xué)比較[J].中國生物工程雜志,2003,23(8)：96-100.

[7]李勇,牛永春.基于瓊脂糖凝膠電泳的小麥SSR擴(kuò)增體系優(yōu)化[J].華北農(nóng)學(xué)報,2009,24(6)：174-177.

[8]王海飛,關(guān)建平,馬鈺,等.中國蠶豆種質(zhì)資源ISSR標(biāo)記遺傳多樣性分析[J].作物學(xué)報,2011,37(4)：595-602.

Application of Novel Nucleic Acid Dye in Agarose Electrophoresis in Sugarbeet Molecular Experiments

WU Ze-dong1,2,3,XU Yan-li4,WANG Hua-zhong1,2,3
（1.Key Laboratory of Sugarbeet Genetics&Breeding,Heilongjiang University,Harbin 150080,China；2.Sugarbeet Research Institute,Chinese Academy of Agricultural Sciences/Crop Research Institute of Heilongjiang University,Harbin 150080,China;3.Key Laboratory of North Sugar Crop Resource and Utilization,Chinese Academy of Agricultural Sciences,Harbin 150080,China;4.Extension Station of Agricultural Techniques of Bole City,Bole,Xinjiang 833400,China）

The feasibility of nucleic acid dyes Goldview(GV)and ethidium bromide(EB)to dye sugarbeet genomic DNA and Lambda DNA were compared.The results of both dyes were similar,enabling to effectively identify samples of more than 20 ng DNA.This suggests on the novel nucleic acid dye GV to substitute carcinogenic EB to detectgenomic DNA of sugarbeet.

beet genome;ethidium bromide;Goldview

S566.301；Q78

：A

1007-2624（2013）02-0015-02

2012-10-31

甜菜現(xiàn)代產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系建設(shè)“甜菜豐產(chǎn)抗病種質(zhì)創(chuàng)新及新品種選育”(CARS-210104-01)。

吳則東（1972-）,男,黑龍江省依蘭縣人,助理研究員,中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院研究生院在讀博士,主要從事甜菜遺傳及分子育種的研究。E-mail：331056376@qq.com

王華忠（1957-）,男,遼寧省西豐縣人,研究員,博士生導(dǎo)師,從事甜菜遺傳育種研究。Tel：0451-86609494,E-mail: wwhhzz0451@sohu.com