申 東，李 莉，高 建

（重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院消化內(nèi)科 400010）

原發(fā)性肝癌（primary hepatic cancer，PHC）是最常見的惡性腫瘤之一，其惡性程度高，往往發(fā)現(xiàn)的時(shí)候已屬晚期，治療效果差，故早期診斷對(duì)于肝癌患者的預(yù)后至關(guān)重要。甲胎蛋白（AFP）目前是應(yīng)用最廣的肝癌標(biāo)志物，在肝癌的診斷、治療及療效監(jiān)測(cè)中具有重要的作用。但是在活動(dòng)性肝病、妊娠、生殖腺胚胎源性腫瘤和少數(shù)腎、胰、結(jié)腸、直腸癌也可有AFP的增高，顯示AFP診斷肝癌的局限性。由于肝細(xì)胞癌具有較高的異質(zhì)性，同時(shí)檢測(cè)兩種或以上的腫瘤生物標(biāo)志物被認(rèn)為是腫瘤早期診斷的較好選擇［1-2］。

熱休克蛋白-27（heat shock protein，HSP-27）是小分子熱休克蛋白亞家族中重要的一員，參與了細(xì)胞的增殖、分化以及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)，與腫瘤關(guān)系密切，是一個(gè)涉及細(xì)胞生長(zhǎng)、細(xì)胞凋亡、腫瘤的發(fā)生和轉(zhuǎn)移等功能的重要蛋白，在乳腺、肝、結(jié)腸、肺等多種腫瘤細(xì)胞中異常過表達(dá)，并與腫瘤的惡性程度有關(guān)［3］。磷脂酰肌醇蛋白聚糖-3（glypican-3，GPC-3）在肝癌組織中高表達(dá)，而在非肝癌組織及正常組織中沒有表達(dá)或表達(dá)量極低，其表達(dá)的陽(yáng)性率高于AFP，有可能成為用于診斷PHC新的腫瘤標(biāo)志物［4］。本實(shí)驗(yàn)通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的HSP-27與GPC-3的表達(dá)情況，探討這二者在肝癌診斷中的臨床意義。

1 材料與方法

1.1 材料 32例肝癌組織、30例肝硬化組織、25例良性肝臟占位組織（14例肝囊腫、11例肝血管瘤組織）取自本院肝膽外科，31例慢性肝炎組織標(biāo)本取自本院消化內(nèi)科及感染科。其中肝癌組織為術(shù)前未經(jīng)放療、化療的原發(fā)性肝癌患者的手術(shù)切除標(biāo)本，均取無(wú)壞死癌組織和無(wú)癌細(xì)胞浸潤(rùn)的癌旁組織。肝癌患者中男22例，女10例；年齡39～83歲（≤50歲12例，＞50歲20例）。血清乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg）陽(yáng)性18例，陰性14例：AFP≤400μg／L 18例，＞400μg／L 14例，瘤體直徑小于或等于5cm 14例，大于5cm 18例。腫瘤組織Edmondson-Steiner分級(jí)：Ⅰ級(jí)6例，Ⅱ級(jí)14例，Ⅲ級(jí)2例，Ⅳ級(jí)10例。肝癌TNM分期Ⅰ期16例，Ⅱ期2例，Ⅲ期12例，Ⅳ期2例。標(biāo)本經(jīng)4%甲醛固定，脫水，常規(guī)石蠟包埋。

1.2 試劑 鼠抗人HSP-27單克隆抗體、鼠抗人GPC-3單克隆抗體均購(gòu)自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，ChemMateTM EnVision／HRP兔／鼠通用型二抗購(gòu)自基因科技（上海有限公司），10mmol／L磷酸鹽緩沖液（PBS）、蘇木素。

1.3 方法 用病理組織切片機(jī)將組織標(biāo)本石蠟塊切成3μm厚切片，再以免疫組織化學(xué)染色二步法（SP法）檢測(cè)HSP-27及GPC-3的表達(dá)。免疫組化主要步驟：石蠟切片脫蠟和水化后，高壓煮沸修復(fù)。切片加50μL過氧化酶溶液，室溫下孵育10min。PBS（pH 7.4）沖洗（3×5min下同）。切片加50μL的非免疫性動(dòng)物血清，室溫下孵育10min，吸去多余的液體。切片加50μL的一抗，室溫下孵育60min或4℃過夜。PBS沖洗3×5min切片加50μL通用型二抗，室溫下孵育10min。PBS沖洗3×5min切片加100μL新鮮配制的DAB溶液，顯微鏡下觀察3～10min。自來水沖洗，蘇木素復(fù)染，中性樹膠封固。

1.4 結(jié)果判定 每張切片在400倍顯微鏡下隨機(jī)取5個(gè)視野，每視野計(jì)數(shù)100個(gè)癌細(xì)胞為基數(shù)，將著色細(xì)胞所占比例的平均數(shù)作為評(píng)定依據(jù)。分為陰性（-），細(xì)胞無(wú)著色或著色細(xì)胞小于5%；弱陽(yáng)性（＋），著色細(xì)胞占5%～25%；陽(yáng)性（＋＋），著色細(xì)胞占26%～50%；強(qiáng)陽(yáng)性（＋＋＋），著色細(xì)胞超過50%。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析。采用χ2檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 HSP-27在肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的表達(dá) HSP-27主要表達(dá)在細(xì)胞質(zhì)，少數(shù)可見胞膜表達(dá)，呈棕黃色。其在肝癌組織中高表達(dá)，陽(yáng)性率56.25%（18／32），而在癌旁組織中未見表達(dá)；HSP-27在30例肝硬化組織中的陽(yáng)性率為20%（6／30），與其在肝癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在肝炎組織、良性肝臟占位組織中均未見表達(dá)，見圖1。

2.2 GPC-3在肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的表達(dá) GPC-3主要表達(dá)在胞質(zhì)中，呈棕褐色。其在肝癌組織中高表達(dá)，陽(yáng)性率87.5%（28／32），在癌旁組織中偶見表達(dá)（3／32）；GPC-3在肝硬化組織中的陽(yáng)性率為40%（12／30），與其在肝癌組織中的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；在肝炎組織、良性肝臟占位組織中均未見表達(dá)，見圖2。

2.3 HSP-27、GPC-3的表達(dá)與原發(fā)性肝癌臨床特征的關(guān)系HSP-27在肝癌組織的表達(dá)，與肝癌細(xì)胞的分化程度及臨床分期有關(guān)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在Ⅲ～Ⅳ級(jí)及Ⅲ～Ⅳ期的肝癌組織中的HSP-27的陽(yáng)性率分別為100.0%、85.7%，明顯高于Ⅰ～Ⅱ級(jí)及Ⅰ～Ⅱ期肝癌組織的HSP-27的陽(yáng)性率；但HSP-27的表達(dá)與患者年齡、性別、腫瘤大小、HB-sAg定性和AFP定量無(wú)關(guān)；GPC-3在肝癌組織的表達(dá)則與腫瘤病理分級(jí)、臨床分期、腫瘤大小、HBsAg定性和AFP定量無(wú)關(guān)，但在性別、年齡上的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），見表1。

圖1 HSP-27在肝癌、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的表達(dá)（SP染色 ×40）

表1 HSP-27、GPC-3的表達(dá)與原發(fā)性肝癌臨床特征的關(guān)系

圖2 GPC-3在肝癌、癌旁、肝硬化、肝炎、良性肝臟占位組織中的表達(dá)（SP染色 ×100）

3 討 論

HSP-27是功能很強(qiáng)并普遍存在的一種分子伴侶，其重要的生物學(xué)功能包括保護(hù)細(xì)胞免受各種應(yīng)激因素的損傷、參與細(xì)胞增殖分化，在細(xì)胞凋亡的多個(gè)關(guān)鍵點(diǎn)起作用，在癌細(xì)胞中表達(dá)水平很高，并參與癌癥的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和化療抵抗等。HSP-27在一些腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)，包括乳腺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、消化道腫瘤等多種惡性腫瘤，并與腫瘤的惡性程度及TNM分期有關(guān)［5］。對(duì)肝腫瘤組織、健康人及乙型肝炎病毒感染者的血清蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，在惡性程度高、侵襲性強(qiáng)的肝癌組織及肝癌患者血清中HSP-27呈高表達(dá)［6］。有研究表明，在對(duì)76例PHC患者的單一診斷及平行診斷中，HSP-27單項(xiàng)的敏感性為59.21%，特異性73.13%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是71.43%，當(dāng)HSP-27與經(jīng)典標(biāo)志物AFP相結(jié)合檢測(cè)PHC時(shí)診斷的敏感性為78.95%，特異性77.61%，陽(yáng)性預(yù)測(cè)值是80.00%［7］。本研究結(jié)果提示，HSP-27在32例肝癌中的陽(yáng)性率明顯高于肝硬化，而在肝炎、良性肝臟占位組織中均未見表達(dá)，且與癌組織的病理分級(jí)及TMN分期有明顯相關(guān)性，低分化及晚期轉(zhuǎn)移性肝癌HSP-27的陽(yáng)性率明顯偏高，而與肝癌患者的年齡、性別、腫瘤大小、HBsAg定性和AFP定量等因素均無(wú)關(guān)，這與文獻(xiàn)［8］報(bào)道的研究結(jié)果相一致，作者推測(cè)HSP-27蛋白在肝癌的發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

GPC-3是一種參與細(xì)胞增殖和胚胎發(fā)育的細(xì)胞膜糖蛋白，在細(xì)胞增殖與分化的發(fā)展過程中發(fā)揮重要作用，通過結(jié)合胞外基質(zhì)、生長(zhǎng)因子和蛋白酶等對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)分化以及腫瘤形成和轉(zhuǎn)移起重要作用［9］。Hsu等［10］報(bào)道了在191例 PHC組織中，143例（74.8%）能檢測(cè)到了GPC-3mRNA，而在156例癌旁“非瘤”肝組織中僅有5例（3.2%）為陽(yáng)性，該5例均為有門脈或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的病例。GPC-3mRNA及其蛋白在PHC組織中的陽(yáng)性率通常為70%左右，而在正常肝臟、肝臟良性腫瘤、慢性肝炎和肝硬化等中均呈陰性［11-12］。Capurro等［13］研究表明，在29例HCC組織中，21例GPC-3蛋白表達(dá)陽(yáng)性，而在正常肝組織及良性肝病組織中未檢測(cè)到GPC-3蛋白，而后用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）法檢測(cè)血清中GPC-3蛋白，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在34例HCC患者中有18例（53%）GPC-3蛋白濃度明顯升高，而在20例肝硬化合并慢性肝炎的患者中僅有1例GPC-3蛋白濃度升高。丁光輝等［14］研究發(fā)現(xiàn)，GPC-3mRNA的表達(dá)與包膜是否完整、有無(wú)癌栓形成、有無(wú)肝內(nèi)轉(zhuǎn)移、性別、年齡及HBsAg均無(wú)關(guān)。本研究結(jié)果顯示，GPC-3在肝癌中的陽(yáng)性率為87.5%明顯高于肝硬化組織（陽(yáng)性率為40%），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），在肝炎、良性肝臟占位組織中均未見表達(dá)，同時(shí)GPC-3與腫瘤的病理分級(jí)、臨床分期、大小、HBsAg定性和AFP定量等無(wú)關(guān)，與上述研究報(bào)道［10-15］相一致，這再次證實(shí)了GPC-3與肝癌有著密切的聯(lián)系，表明GPC-3可作為新的肝癌腫瘤標(biāo)記物。而GPC-3在患者性別、年齡方面的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異有可能與樣本數(shù)量較少有關(guān)，故進(jìn)一步的大樣本研究是必要的。

綜上所述，HSP-27和GPC-3在肝癌組織中高表達(dá)，而在肝硬化組織中低表達(dá)，在肝炎、良性肝臟占位組織中不表達(dá)，表明HSP-27和GPC-3與肝癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移有著密切聯(lián)系，可成為潛在的肝癌診斷標(biāo)志物，對(duì)提高肝癌的檢出率以及肝癌預(yù)后判斷都有重要意義，進(jìn)一步的研究以明確HSP-27及GPC-3表達(dá)調(diào)控異常在肝癌發(fā)生中的機(jī)制，可能為肝癌的靶向治療開辟新的前景。

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