熊輝強，王鶴齡，羅 璝，劉紅兵，劉月輝，張少容△

（1.江西省豐城市人民醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科 331100；2.南昌大學第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科，南昌330006）

腫瘤細胞能否被機體的免疫系統(tǒng)攻擊與細胞內的促吞噬和抗吞噬信號的平衡表達有關。斯坦福大學醫(yī)學院的研究人員發(fā)現(xiàn)多種惡性腫瘤細胞表面攜帶了促吞噬作用的鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT），其可發(fā)送信號招募巨噬細胞吞噬并消化這些腫瘤細胞，引起機體的抗腫瘤免疫反應。研究人員還證實腫瘤細胞表面的這個“來吃我”信號可被另一條獨立的“別吃我”CD47信號抵消。這一發(fā)現(xiàn)為某些惡性腫瘤的治療帶來了新希望［1］。CRT和CD47的表達已經(jīng)在多種人類惡性腫瘤組織中被發(fā)現(xiàn)。盡管如此，CRT和CD47表達的臨床意義仍然不明確，存有爭議。因此，本文通過RT-PCR和免疫組織化學法檢測促吞噬和抗吞噬信號作用的CRT和CD47在喉鱗癌組織中的表達水平，研究二者在喉鱗狀上皮細胞癌（laryngeal squamous cell carcinoma，LSCC）發(fā)生、發(fā)展中的作用，評估CRT、CD47的表達是否和LSCC的免疫發(fā)生有關。

1 資料與方法

1.1 一般資料 42例喉癌患者癌組織標本及18例癌旁正常組織標本（安全界外1cm）均收集于2010年1月至2011月5月南昌大學第二附屬醫(yī)院耳鼻咽喉頭頸外科手術患者，所有標本及時裝入含有RNAstore酶的凍存管中，-80℃冰箱凍存，用于RT-PCR檢測。同時選取病理科2008年1月至2011年5月原發(fā)性LSCC病理存檔蠟塊68例，其中，男62例，女6例，年齡47～79歲，平均61.5歲，包括高分化LSCC 28例，中低分化LSCC 40例；隨機選取同期20例癌旁正常組織作為對照組。上述所取所有癌組織標本術后均經(jīng)病理檢查證實為喉鱗狀上皮細胞癌。所有患者術前均未做放、化療。

1.2 總RNA的提取及RT-PCR 總RNA的提取參照TRNzol試劑說明書進行操作，將所得的RNA沉淀、洗滌、晾干，溶于RNase-free ddH2O中。測定吸光光度值，電泳判定RNA的完整性，取A260／A280比值為1.8～2.0的RNA逆轉錄成cDNA，cDNA的合成參照TaKaRa逆轉錄試劑說明書操作，將所得的cDNA產(chǎn)物保存于-20℃冰箱中，用于PCR。引物由上海捷瑞生物工程有限公司設計并合成，CRT引物序列，sense：5′-ACA ACT TCC TCA TCA CCA AC-3′；antisense：5′-TCA TCC TCC TCA TCC TCA TC-3′，產(chǎn)物長度為211bp。CD47引 物 序 列，sense：5′-CCT TCG TCA TTG CCA TA TTG-3′；antisense：5′-TAG GAG GTT GTA TAG TCT TCT G-3′，產(chǎn)物長度為201bp。人β-actin作為內參照，其序列為：sense：5′-TGG AAG GTG GAC AGC GAG G-3′；antisense：5′-CGG GAA ATC GTG CGT GAC-3′，產(chǎn)物長度為 434bp。PCR反應體系為50μL，包括：Premix Taq 25μL、cDNA 2μL、上下游引物各1μL，加滅菌蒸餾水至50μL。PCR反應條件為：94℃預變性5min，然后進行30個循環(huán)的擴增（94℃變性30s，引物退火溫度30s，72℃延伸1min／kbp），最后72℃延伸5min。將所得PCR擴增產(chǎn)物凝膠電泳，對電泳結果進行掃描拍照。

1.3 免疫組織化學 采用鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化酶法（SP）檢測LSCC組織中CRT、CD47蛋白及淋巴細胞的表達水平，CRT及CD47單克隆抗體為SANTA CRUZ產(chǎn)品，CD3、CD45RO單克隆抗體及SP染色試劑盒購于北京中杉金橋生物公司，抗體工作濃度為1∶100。組織切片脫蠟至水后抗原修復、室溫孵育，加一抗37℃孵育2h，具體操作參照其說明書嚴格進行，經(jīng)DAB顯色，蘇木精對比染色后，中性樹膠封片。免疫組織化學陽性結果判斷：在每張切片上隨機選取10個（×400）高倍視野相同范圍下計數(shù)，并根據(jù)陽性細胞數(shù)及染色強度區(qū)分陽性等級。（1）陽性細胞數(shù)少于1%的為0分，陽性細胞小于10%為1分，11%～50%為2分，大于51%為3分；（2）染色強度：陰性為0分，弱陽性1分，中等陽性2分，強陽性3分?？贵w得分為（1）＋（2）。得分為3～6分者為陽性，小于3分者為陰性［3］。癌組織中淋巴細胞浸潤的計數(shù)按照 Hussein′s方法［2］，選取癌組織間質和實質中淋巴細胞高浸潤的10個高倍視野區(qū)作為計數(shù)區(qū)域，避免選取腫瘤壞死區(qū)域，由2名觀察者同時計數(shù)淋巴細胞，結果用±s表示。癌組織間質中CD3＋細胞大于16個／HP為高浸潤，小于或等于16個／HP為低浸潤；CD45RO＋細胞大于24個／HP為高浸潤，小于或等于24個／HP為低浸潤。癌組織實質中CD3＋細胞大于8個／HP為高浸潤，小于或等于8個／HP為低浸潤；CD45RO＋細胞大于14個／HP為高浸潤，小于或等于14個／HP為低浸潤。

1.4 統(tǒng)計學處理 應用SPSS16.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學處理，計量資料以±s表示，兩樣本均數(shù)比較采用近似t檢驗，計數(shù)資料采用χ2檢驗或Fisher精確檢驗、線性相關分析，檢驗水準α＝0.05。

2 結 果

2.1 RT-PCR檢測結果 PCR產(chǎn)物電泳結果見圖1。在本實驗中，通過對42例LSCC新鮮標本進行RT-PCR檢測，發(fā)現(xiàn)22例可見CRT mRNA的強表達，3例為弱表達，其余未見CRT mRNA的表達，CRT mRNA在LSCC中的陽性表達率為59.5%；18例癌旁正常組織中CRT mRNA僅2例為弱表達，陽性表達率為11.1%，CRT mRNA在LSCC組織及癌旁正常組織中的相對表達量分別為（0.608 1±0.357 6）和（0.248 6±0.156 9）。在42例LSCC中，CD47mRNA的陽性表達率為54.8%（23／42），在18例癌旁正常組織中CD47mRNA低表達4例，陽性率為22.2%（4／18），CD47mRNA 在 LSCC組織及癌旁正常組織中的相對表達量分別為（0.563 7±0.350 1）和（0.260 7±0.172 9），CRT mRNA、CD47mRNA在LSCC組織中的表達明顯高于癌旁正常組織（P＜0.05）。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳結果

圖2 CRT蛋白表達（SP，×200）；

圖3 CD47蛋白的表達（SP，×200）；

圖4 間質中CD3＋T淋巴細胞表達（SP，×200）；

圖5 間質中CD45RO＋T淋巴細胞（SP，×200）；

圖6 實質中CD3＋T淋巴細胞表達（SP，×400）；

圖7 實質中CD45RO＋T淋巴細胞（SP，×400）

2.2 免疫組織化學檢測結果 CRT蛋白主要表達于胞漿、胞膜中，細胞核及細胞外基質中未見表達，鏡下陽性細胞呈棕黃色（圖2）。在68例LSCC組織中，33例可見不同程度的陽性表達，其余35例未見表達。20例癌旁正常鱗狀上皮組織中CRT蛋白僅1例呈弱陽性表達。CRT蛋白在LSCC組織中的表達水平明顯高于癌旁正常鱗狀上皮組織（P＜0.05）。本實驗研究了CRT與患者性別、吸煙、腫瘤T分期、淋巴結轉移、臨床分期、組織分化程度、CD3＋T細胞及CD45RO＋T細胞浸潤8項臨床病理參數(shù)的關系，結果顯示CRT隨著腫瘤分期、淋巴結轉移及臨床分期的增加，CRT蛋白的表達亦增加（P＜0.05），CRT陽性的表達和癌組織間質和實質中高浸潤的CD45RO＋細胞呈正相關，而與癌組織間質和實質中CD3＋細胞浸潤及患者的其他臨床病理參數(shù)（患者性別、吸煙、組織分化程度）無相關性（表1）。CD47蛋白的表達主要位于細胞膜表面，細胞質中亦見部分表達，細胞核中未見到表達（見圖3）。CD47蛋白在LSCC中的表達率為42.6%（29／68），在癌旁正常鱗狀上皮組織中的表達率為15%（3／20），CD47蛋白在LSCC中的表達明顯高于癌旁正常鱗狀上皮組織（P＜0.05）。通過與LSCC臨床病理參數(shù)的分析發(fā)現(xiàn)，CD47蛋白的表達與LSCC的腫瘤分期、淋巴結轉移、臨床分期及癌組織實質中CD45RO＋T細胞的浸潤密切相關（P＜0.05），而與患者性別、吸煙、組織分化程度、CD3＋T細胞及癌組織間質中CD45RO＋T細胞的浸潤均無相關性（表1）。CD47蛋白的表達隨著CRT蛋白的表達增加而增加，其與CRT蛋白的表達呈正相關（Pearson相關系數(shù)r＝0.89 P＜0.05）。

表1 CRT、CD47蛋白與LSCC臨床病理參數(shù)及淋巴細胞的關系

3 討 論

3.1 CRT mRNA和蛋白表達 CRT是一種相對分子質量為46×103Ca2＋結合蛋白，由人19號染色體上單一基因編碼，包含9個外顯子及3個不同的結構域（N、P和C），具有高度的進化保守性［3］。CRT具有多種功能，參與伴侶分子活性及細胞內Ca2＋環(huán)境平衡的調節(jié)，細胞間黏附信號的調控，內質網(wǎng)中折疊和低聚反應過程中粘蛋白的合成，以及抑制血管生成和腫瘤細胞生長［4］。Panaretakis等［5］研究表明，細胞表面的CRT暴露，能提供一種“來吃我”信號，招募樹突狀細胞（DCs）和巨噬細胞，導致免疫反應。CRT的表達已經(jīng)在多種腫瘤中被發(fā)現(xiàn)，例如黑色素瘤、肝癌、肺癌、乳腺癌、胰腺癌及前列腺癌［6］，CRT被證實參與了多種腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。

在本研究中，CRT mRNA和蛋白在LSCC中的表達均明顯高于它的鄰近正常上皮組織（P＜0.05），提示CRT可能與抑制LSCC癌變的發(fā)生有關，CRT的抑癌活性與CRT對腫瘤細胞免疫原性的產(chǎn)生有關。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細胞死亡的免疫原性依靠細胞膜表面的CRT的暴露，CRT暴露后能被吞噬細胞或者其他抗原提呈細胞識別（APCs）而被吞噬，在APCs期間，腫瘤相關抗原（TAA）或者腫瘤特異性抗原（TSA）同時被處理，并呈提給相應的T淋巴細胞，最后引起特異性抗腫瘤免疫反應，抑制腫瘤的發(fā)生［7］。本研究通過對癌組織間質和實質中淋巴細胞的檢測發(fā)現(xiàn)，CRT的表達伴隨CD45RO＋T細胞的高浸潤，二者呈正相關（P＜0.05），與CD3＋T細胞無相關性（P＞0.05），表明免疫反應中產(chǎn)生的CD45RO＋T細胞可能參與了腫瘤的發(fā)生過程。Peng等［8］在研究CRT在ⅢB期結腸癌中的表達亦發(fā)現(xiàn)，CRT陽性的表達和高浸潤的CD45RO＋細胞有關，認為發(fā)生在結腸癌中的CRT表達和免疫反應有關。在免疫反應中產(chǎn)生的效應細胞（例如CD3＋T細胞、CD45RO＋T細胞和巨噬細胞）浸潤癌組織時，能抑制癌組織的發(fā)生、發(fā)展［9］。

本研究通過檢測不同腫瘤分期、臨床分期及淋巴結轉移組的CRT表達發(fā)現(xiàn)，CRT隨著腫瘤、臨床分期及淋巴結轉移的增加，CRT的表達率逐漸升高，提示CRT在LSCC的發(fā)展、侵襲轉移中起重要作用。Alur等［10］研究表明，CRT在前列腺癌中的過度表達能抑制前列腺癌細胞的生長和轉移，它的抑制功能發(fā)揮需要富含脯氨酸P-區(qū)域，該區(qū)域包括2個序列重復結構，能形成一種擴展的支臂結構使其能結合到其他的伴侶分子，例如ERp57，或者通過影響細胞內Ca2＋的儲藏來發(fā)揮抑制腫瘤細胞生長的作用，從而抑制前列腺癌的發(fā)展。還有報道表明CRT能通過增加細胞與細胞間、細胞與基質間黏附發(fā)揮抑制浸潤和轉移作用。Vougas等［11］認為CRT在低分化的結腸癌中的表達高于高分化結腸癌，盡管如此，在本研究中CRT的表達和不同病理分化程度無關（P＞0.05）。

3.2 CD47mRNA和蛋白表達 CD47，又稱整聯(lián)蛋白（integrin-associated protein，IAP），是一種廣泛表達于細胞膜表面的免疫球蛋白樣蛋白質，由特定的整聯(lián)蛋白、G蛋白及膽固醇組成的超分子復合物［12］。CD47的配體為信號調節(jié)蛋白alphα鏈（signal regulatory proteinαchain，SIRPα），CD47和SIRPα組成細胞間通訊系統(tǒng)（CD47-SIRPα系統(tǒng)），其在多種細胞進程中發(fā)揮重要作用，包括細胞遷移、B細胞的黏附和T細胞凋亡的活化，此外，CD47-SIRPα系統(tǒng)也與巨噬細胞的吞噬作用的負調節(jié)有關，CD47通過與SIRPα結合產(chǎn)生抑制抗性信號，下調巨噬細胞的吞噬作用，進而對固有免疫系統(tǒng)產(chǎn)生抑制作用［13］。在治療上，抗CD47單克隆抗體能結合CD47-SIRPα復合體從而促進腫瘤細胞被巨噬細胞吞噬。

Chao等通過檢測不同腫瘤細胞和正常細胞中的CRT和CD47的表達發(fā)現(xiàn)，CRT陽性的細胞同時伴有高水平的CD47表達，CRT和CD47的表達有一種較強的正相關性。本研究通過檢測LSCC和癌旁正常上皮組織中的CD47表達發(fā)現(xiàn)，CD47 mRNA和蛋白在LSCC組織中的表達要高于癌旁正常上皮組織，同時CD47蛋白的表達隨著腫瘤、臨床分期及淋巴結轉移的增加，CD47的表達率逐漸升高.線性相關分析表明CD47的表達和CRT呈正相關（Pearson相關系數(shù)r＝0.89 P＜0.05），提示CD47亦參與LSCC的發(fā)生、發(fā)展過程。CD47主要表現(xiàn)在能促使LSCC癌變的發(fā)生和發(fā)展。其機制可能與高水平或者上調表達的CD47能抵抗CRT的促吞噬及免疫激活功能，從而允許雖有CRT表達的細胞不被吞噬并獲得額外的突變，最后轉化成惡性細胞。Majeti等［14］在小鼠體內的實驗顯示，人類白血病干細胞（LSC）通過上調CD47表達，利用人CD47-鼠SIRPα機制來逃避巨噬細胞對LSC的吞噬作用，使其逃避了機體的固有免疫系統(tǒng)的殺傷作用，促使腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。程千松等［15］研究表明CD47對T細胞凋亡過程有活化作用，能為T細胞凋亡的激活提供共刺激信號，增強T細胞受體（T cell receptor，TCR）信號轉導的效率。而在本研究中，通過評估CD47的表達和癌組織間質與實質中T淋巴細胞浸潤的關系，發(fā)現(xiàn)CD47陽性細胞的表達和癌組織實質中CD45RO＋T細胞的高浸潤正相關（P＜0.05），而與癌組織間質中CD45RO＋T細胞及CD3＋T細胞的浸潤無明顯相關性（P＞0.05）。

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