何章彪，曹翠萍，劉衛(wèi)華，趙 琳，魏抗抗，王翠俠，陳奎生

（1.鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科，鄭州450052；2.商丘醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，河南商丘476100；3.河南省商丘市第一人民醫(yī)院 476100）

神經(jīng)軸突導(dǎo)向因子-1（Netrin-1）是層黏連蛋白相關(guān)的分泌蛋白，在調(diào)節(jié)神經(jīng)軸突生長(zhǎng)、缺氧促進(jìn)腫瘤血管生成、調(diào)節(jié)白細(xì)胞遷移等方面發(fā)揮重要作用。而血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（VEGF）是目前所知的作用最強(qiáng)的促血管形成因子之一，在腫瘤血管形成中起重要作用［1］。有關(guān)食管鱗癌組織中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表達(dá)及其意義尚未見文獻(xiàn)報(bào)道。作者采用免疫組織化學(xué)與原位雜交方法觀察食管鱗癌組織中Netrin-1、VEGF的蛋白及mRNA表達(dá)，從而探討其與食管癌發(fā)生、發(fā)展及浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的關(guān)系以及VEGF和Netrin-1的相關(guān)性。

1 資料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)標(biāo)本 組織標(biāo)本系河南省商丘市第一人民醫(yī)院2011年3月至2012年3月食管癌新鮮手術(shù)切除標(biāo)本，共50例，病理檢查證實(shí)均為鱗癌，并取相應(yīng)的癌旁不典型增生標(biāo)本19例及正常食管黏膜標(biāo)本20例。食管鱗癌患者中，男33例，女17例，年齡40～74歲。50例食管標(biāo)本按有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移分為：轉(zhuǎn)移組14例和無轉(zhuǎn)移組36例。術(shù)前均未接受放化療。

1.2 實(shí)驗(yàn)試劑 Netrin-1、VEGF免疫組織化學(xué)SP試劑盒及Netrin-1、VEGF原位雜交試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；VEGF鼠抗人單克隆抗體、Netrin-1兔抗人抗體購買于北京中杉試劑公司；胃蛋白酶、預(yù)雜交液及核固紅均購自武漢博士德生物工程有限公司；SP-AP（streptavidin A1-kaline phosphatase）及BCIP／NBT購自美國Promega公司，Netrin-1探針（5′-GGA AGT TCA CGG TGA ACA T-3′），VEGF探針（5′-GTC ATG GAA TCC ATC TGT TGA GT-3′）由北京奧科生物技術(shù)有限責(zé)任公司合成。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本處理 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及正常食管黏膜組織經(jīng)40g／L的多聚甲醛固定，石蠟包埋，用于免疫組織化學(xué)及原位雜交檢測(cè)。

1.3.2 免疫組織化學(xué) 免疫組織化學(xué)SP法染色步驟按照試劑盒及一抗（濃度為1∶100）說明書要求進(jìn)行，同時(shí)用購自武漢博士德公司（Netrin-1）及北京中杉試劑公司（VEGF）的陽性對(duì)照片進(jìn)行陽性對(duì)照及用PBS代替一抗作陰性對(duì)照。

1.3.3 原位雜交 參照原位雜交試劑盒說明書操作，以不含探針的預(yù)雜交液進(jìn)行雜交及雜交前用RNase處理樣本作陰性對(duì)照。

1.3.4 免疫組織化學(xué)及原位雜交結(jié)果判定 在顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，每張切片觀察10個(gè)視野（×200），并取均數(shù)。按陽性細(xì)胞數(shù)所占的百分比分為：陰性：陽性細(xì)胞數(shù)小于5%；弱陽性：陽性細(xì)胞數(shù)占5%～25%；陽性：陽性細(xì)胞數(shù)占25%～50%；強(qiáng)陽性：陽性細(xì)胞數(shù)大于50%。為便于統(tǒng)計(jì)，將弱陽性和陰性歸為陰性，陽性和強(qiáng)陽性歸為陽性［2］。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用SPSS13.0軟件數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，行χ2檢驗(yàn)及列聯(lián)表的關(guān)聯(lián)性分析，檢驗(yàn)標(biāo)準(zhǔn)α＝0.05。

2 結(jié) 果

2.1 免疫組織化學(xué)與原位雜交結(jié)果 Netrin-1蛋白陽性信號(hào)位于正常食管鱗狀上皮細(xì)胞、食管癌細(xì)胞或癌旁不典型增生細(xì)胞胞膜，在細(xì)胞與細(xì)胞的接觸面的表達(dá)更為清晰，呈棕黃色顆粒（圖1A）。Netrin-1mRNA陽性信號(hào)位于正常食管鱗狀上皮細(xì)胞、食管癌癌細(xì)胞或癌旁不典型增生細(xì)胞胞質(zhì)中，呈藍(lán)紫色顆粒（圖1B）；VEGF蛋白陽性表達(dá)主要定位于細(xì)胞胞質(zhì)（圖1C）。VEGF mRNA陽性信號(hào)位于正常食管鱗狀上皮細(xì)胞、食管癌癌細(xì)胞或癌旁不典型增生細(xì)胞胞質(zhì)中，呈藍(lán)紫色顆粒（圖1D）。

2.2 食管鱗癌組織中Netrin-1、VEGF的蛋白及mRNA表達(dá)見表1。食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織與正常食管黏膜組織中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表達(dá)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 食管鱗癌組織中VEGF、Netrin-1蛋白及mRNA的影像學(xué)表現(xiàn)（SP，×400）

表1 食管鱗癌組織、癌旁不典型增生組織及其正常組織中Netrin-1、VEGF蛋白及mRNA表達(dá)比較［n（%）］

表2 VEGF及mRNA蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

表3 Netrin-1及mRNA蛋白的表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系

2.3 Netrin-1及VEGF蛋白表達(dá)與食管癌轉(zhuǎn)移的關(guān)系 見表2～3。有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的食管鱗癌組織中Netrin-1蛋白及mRNA、VEGF蛋白及mRNA表達(dá)均高于無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的相應(yīng)組織（P＜0.05）。

2.4 VEGF和Netrin-1的相關(guān)性 在VEGF蛋白表達(dá)陽性病例中，Netrin-1蛋白表達(dá)陽性率為91.18%（31／34），VEGF蛋白表達(dá)陰性病例中Netrin-1蛋白表達(dá)陽性12.50%（2／16），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示列聯(lián)系數(shù)（contingency coefficient）r＝0.941 3，P＜0.01，提示兩種蛋白在食管癌組織中的表達(dá)成正相關(guān)性。在VEGF mRNA表達(dá)陽性病例中，Netrin-1mRNA表達(dá)陽性率為89.29%（25／28），VEGF mRNA表達(dá)陰性病例中 Netrin-1mRNA表達(dá)陽性率為9.09%（2／22），經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，結(jié)果顯示列聯(lián)系數(shù)r＝0.584 7，P＜0.01，提示兩種 mRNA在食管癌組織中的表達(dá)成正相關(guān)性。

3 討 論

Netrin家族是一類與層黏連蛋白相關(guān)的可分泌蛋白，也是重要的神經(jīng)突起導(dǎo)向因子，在結(jié)構(gòu)上高度保守［3］。Netrin-1是Netrin基因家族中研究較多的重要成員之一。近年研究結(jié)果顯示，Netrin-1可通過調(diào)節(jié)腫瘤血管生成調(diào)節(jié)腫瘤的形態(tài)發(fā)生和發(fā)展、轉(zhuǎn)移［4］。2004年，Park等［5］在 PNAS上率先報(bào)道 Netrin-1是一血管生成因子，既能促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞增生、遷移和黏附，增生效應(yīng)類似于經(jīng)典的內(nèi)皮細(xì)胞促進(jìn)因子——血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子；又能促平滑肌細(xì)胞增生，效應(yīng)等同于經(jīng)典的平滑肌細(xì)胞促進(jìn)因子——血小板源性生長(zhǎng)因子。幾乎與此同時(shí)，F(xiàn)itamant等［6］報(bào)道，去除Netrin-l基因表達(dá)，會(huì)導(dǎo)致內(nèi)皮端細(xì)胞偽足迷亂、過度分支和方向異常，提示Netrin-l具有調(diào)控血管方向和形態(tài)發(fā)生功能。

Netrin-1與惡性腫瘤侵襲性的關(guān)系也受到重視。Otrock等［7］基于Netrin-l轉(zhuǎn)基因小鼠的研究證實(shí)，Netrin-l在轉(zhuǎn)基因小鼠的結(jié)腸中高表達(dá)，而其受體DCC和UNC5H在所有腸上皮細(xì)胞中均有表達(dá)，與之相應(yīng)的表型是結(jié)腸增生和腺瘤發(fā)生頻率增高，提示Netrin-1可能作為原癌基因在結(jié)腸癌的早期發(fā)揮重要作用。Mehlen等［8］發(fā)現(xiàn)Netrin-1與乳腺癌細(xì)胞的存活及轉(zhuǎn)移關(guān)系密切，認(rèn)為Netrin-1有利于轉(zhuǎn)移的乳腺癌細(xì)胞存活，但不足以導(dǎo)致形成癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移灶；Netrin-l的表達(dá)量有利于判斷乳腺癌的轉(zhuǎn)移性，如乳腺癌組織中Netrin-l高表達(dá)，則轉(zhuǎn)移性強(qiáng)。近來有研究表明，在92例非小細(xì)胞肺癌中，Netrin-1高表達(dá)的有43例（占47%）；且通過增強(qiáng)或減弱Netrin-1表達(dá)對(duì)腫瘤的影響研究可能存在的聯(lián)系，結(jié)果提示Netrin-1有可能成為治療肺癌的新靶點(diǎn)［9］。本研究顯示Netrin-1表達(dá)在淋巴轉(zhuǎn)移的患者中陽性表達(dá)明顯升高，表明Netrin-l在食管癌中的表達(dá)上調(diào)可能在食管癌癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Netrin-1在食管癌侵襲轉(zhuǎn)移過程中扮演重要角色，可能被作為腫瘤基因治療的新靶點(diǎn)進(jìn)行研究。

VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的促血管形成因子之一，也是腫瘤細(xì)胞分泌的血管形成因子中最重要的一種，新血管形成是保證腫瘤生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的組織學(xué)基礎(chǔ)，受多種促血管因子和抗血管生成因子的雙重調(diào)節(jié)。據(jù)報(bào)道，食管鱗癌陽性率為23.9%～93.3%，本研究為68.0%。VEGF主要表達(dá)于癌細(xì)胞，具有明顯的異質(zhì)性，強(qiáng)陽性表達(dá)的細(xì)胞多位于浸潤(rùn)前緣，在血管內(nèi)皮不表達(dá)或極少量表達(dá)，與 Mbius等［10］的報(bào)道相似。推測(cè)VEGF主要以旁分泌途徑作用于血管內(nèi)皮細(xì)胞。VEGF是高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂原［11］，是腫瘤新生血管生成的重要調(diào)控因子［12］，不僅參與腫瘤血管生成、增殖，還直接與腫瘤浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移有關(guān)，且其表達(dá)水平與腫瘤的惡性程度有關(guān)［13］。VEGF與食管鱗狀細(xì)胞癌的浸潤(rùn)程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移呈正相關(guān)。因此，可以作為判定食管癌生物學(xué)行為的檢測(cè)及預(yù)后指標(biāo)［14］。本研究顯示，VEGF在食管癌中的表達(dá)與癌旁非典型增生組織及正常食管黏膜組織比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。提示VEGF可誘導(dǎo)食管癌腫瘤血管形成，提高其通透性，促使腫瘤細(xì)胞浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移、惡性程度增加。

VEGF是目前已知作用最強(qiáng)的促血管形成因子之一，而Netrin-1可通過調(diào)節(jié)腫瘤血管生成調(diào)節(jié)腫瘤的形態(tài)發(fā)生和發(fā)展、轉(zhuǎn)移［15］。因此，Netrin-1和VEGF基因蛋白之間可能有協(xié)同作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示Netrin-1和VEGF基因蛋白在正常食管黏膜組織中基本不表達(dá)，而在食管癌組織中有不同程度的陽性表達(dá)，食管癌中VEGF及Netrin-1的表達(dá)存在正相關(guān)性。它們以不同的機(jī)制促進(jìn)了食管癌的發(fā)生、發(fā)展、侵襲和轉(zhuǎn)移。對(duì)食管癌患者進(jìn)行Netrin-1和VEGF的聯(lián)合檢測(cè)，有可能作為食管癌的診斷和評(píng)估其預(yù)后的重要分子生物學(xué)指標(biāo)。判斷食管癌的侵襲和轉(zhuǎn)移能力，為術(shù)后高?；颊咧朴喓侠淼闹委煼桨讣胺乐鼓[瘤的復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移提供可靠的依據(jù)。但是，在體內(nèi)食管癌侵襲、轉(zhuǎn)移過程中，Netrin-1基因的作用及其分子機(jī)制，還有待進(jìn)一步研究。

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