羅良鳴，吳玉鋒，倪維成，朱華

（1.溫州醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，浙江溫州 325035；2.溫州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江溫州 325000；3.諸暨市公安局刑偵大隊(duì)，浙江諸暨 311800；4.平陽(yáng)縣公安局刑事技術(shù)室，浙江平陽(yáng) 325400）

嗎啡戒斷大鼠中腦腹側(cè)背蓋區(qū)GAP－43的表達(dá)變化

羅良鳴1，2，吳玉鋒3，倪維成4，朱華1

（1.溫州醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系，浙江溫州 325035；2.溫州市公安局刑事科學(xué)技術(shù)研究所，浙江溫州 325000；3.諸暨市公安局刑偵大隊(duì)，浙江諸暨 311800；4.平陽(yáng)縣公安局刑事技術(shù)室，浙江平陽(yáng) 325400）

目的觀察嗎啡戒斷大鼠中腦腹側(cè)背蓋區(qū)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）在不同時(shí)程中的表達(dá)，探討GAP-43在嗎啡戒斷記憶中的作用。方法采用腹腔遞增注射鹽酸嗎啡并自然戒斷的方法建立嗎啡依賴1周、2周和4周戒斷模型，運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色觀察中腦腹側(cè)背蓋區(qū)GAP-43的蛋白表達(dá)，并用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件對(duì)結(jié)果進(jìn)行分析。結(jié)果中腦腹側(cè)背蓋區(qū)GAP-43的蛋白表達(dá)隨依賴時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為先降低再升高（P＜0.01）。結(jié)論GAP-43可能在中腦腹側(cè)背蓋區(qū)參與了嗎啡戒斷記憶。

法醫(yī)病理學(xué)；嗎啡依賴；生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43；大鼠

近年來(lái)研究表明，學(xué)習(xí)記憶在成癮行為的形成和保持中發(fā)揮了重要的作用，兩者具有相同的分子通路、受相同的神經(jīng)因子調(diào)節(jié)、數(shù)個(gè)信號(hào)傳導(dǎo)通路相同、均有相似的神經(jīng)元形態(tài)適應(yīng)性改變和突觸可塑性變化等[1]。藥物成癮的真正原因就是成癮記憶，同時(shí)成癮記憶在藥物依賴中的作用已受到了高度重視[2]。本研究通過(guò)觀察嗎啡戒斷大鼠與成癮記憶相關(guān)的中腦腹側(cè)背蓋區(qū)生長(zhǎng)相關(guān)蛋白-43（growth associated protein-43，GAP-43）不同時(shí)程的表達(dá)，探討GAP-43在嗎啡戒斷記憶中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

鹽酸嗎啡（1mL∶1mg，沈陽(yáng)第一制藥廠），鹽酸納洛酮（2 mL∶2 mg，北京四環(huán)制藥廠），兔抗鼠GAP－43多克隆抗體、羊抗兔二抗（北京博奧森生物技術(shù)有限公司）。

Olympus BX51生物顯微鏡（日本Olympus公司）。

1.2 方法

1.2.1 嗎啡依賴戒斷模型的建立

健康SD大鼠24只（3月齡），雌雄不限，體質(zhì)量（250±20）g，由溫州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。采用腹腔遞增注射鹽酸嗎啡的方法，每天2次（8：00和16：00），連續(xù)7 d，每天的劑量依次為5、10、15、20、30、40、50 mg/kg，期間每天稱體質(zhì)量1次。第8天在6：00注射鹽酸納洛酮5mg/kg以誘發(fā)戒斷癥狀，參照文獻(xiàn)[3]的方法和評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)，觀察大鼠濕狗樣顫抖、伸展、清理皮毛、吞咽、站立、跳躍、齒顫、上瞼下垂、流涎、腹瀉等戒斷癥狀，并進(jìn)行評(píng)分。

1.2.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組

確認(rèn)成功建立嗎啡依賴戒斷模型后，按隨機(jī)原則分為嗎啡依賴1周戒斷組、2周戒斷組、4周戒斷組和對(duì)照組。每組6只大鼠，分籠喂養(yǎng)，自由進(jìn)食、飲水。觀察其活動(dòng)、飲食量、飲水量、大便等情況。1周戒斷組自然戒斷1周，2周戒斷組繼續(xù)給予50mg/kg鹽酸嗎啡腹腔注射，每天1次（8：00），注射1周后自然戒斷1周，4周戒斷組按上述方法注射3周后自然戒斷1周，對(duì)照組采用與實(shí)驗(yàn)組相同劑量的生理鹽水在相同時(shí)間間隔注射。

1.2.3 GAP-43免疫組織化學(xué)染色

各組大鼠自然戒斷1周后用戊巴比妥鈉麻醉，灌注固定，參照鼠立體定位圖譜，冠狀取中腦腹側(cè)背蓋區(qū)檢材（含周邊組織），包埋切片。4組用于比較的組織同貼在一張玻片上，按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色。切片脫蠟至水，0.01mol/L、pH=6.0檸檬酸緩沖液高壓熱抗原修復(fù)5min，含3%H2O2的50%乙醇溶液消除內(nèi)源性過(guò)氧化物酶30min，滅活普通羊血清封閉內(nèi)源性抗原30min，加兔抗鼠GAP-43多克隆抗體，37℃過(guò)夜，加羊抗兔二抗，37℃2h，DAB染色，蘇木素復(fù)染后觀察拍片，每個(gè)步驟間均用PBS洗片。對(duì)照組用滅活普通羊血清取代一抗，其余同模型組。

1.2.4 顯微圖像分析處理

圖1 各組中腦腹側(cè)背蓋區(qū)GAP-43免疫組織化學(xué)染色結(jié)果DAB×400

每只大鼠中腦腹側(cè)背蓋區(qū)取6張切片，每張切片核團(tuán)區(qū)域各取5個(gè)視野（×400），用Olympus BX51生物顯微鏡攝片，Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件進(jìn)行光密度測(cè)定，并以胼胝體光密度作為基準(zhǔn)，得到校正值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用x ±s表示，用t檢驗(yàn)進(jìn)行差異性分析。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.01。

2 結(jié)果

2.1 嗎啡依賴戒斷大鼠模型評(píng)分結(jié)果

通過(guò)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠戒斷癥狀的觀察，發(fā)現(xiàn)嗎啡依賴大鼠戒斷后出現(xiàn)明顯戒斷癥狀，各組戒斷癥狀評(píng)分結(jié)果見(jiàn)表1。1周、2周、4周戒斷組評(píng)分均高于對(duì)照組（P＜0.01），說(shuō)明嗎啡依賴大鼠模型建立成功。

表1 嗎啡依賴戒斷癥狀評(píng)分結(jié)果（n=6，±s）

表1 嗎啡依賴戒斷癥狀評(píng)分結(jié)果（n=6，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.01

組別戒斷癥狀評(píng)分對(duì)照2.1±2.2 1周戒斷28.2±5.11）2周戒斷24.5±3.21）4周戒斷22.5±3.91）

2.2 GAP-43免疫組織化學(xué)染色結(jié)果

在各組實(shí)驗(yàn)大鼠中腦腹側(cè)背蓋區(qū)，神經(jīng)細(xì)胞胞漿和突起內(nèi)均可見(jiàn)免疫反應(yīng)產(chǎn)物（棕黃色顆粒）沉積，膠質(zhì)細(xì)胞未見(jiàn)表達(dá)。對(duì)照組棕黃色顆粒明顯且密集，1周戒斷組棕黃色顆粒淺淡而稀疏，2周戒斷組棕黃色顆粒欠明顯但密集，4周戒斷組棕黃色顆粒明顯且密集（圖1）。

用Image-Pro Plus 5.1圖像分析軟件進(jìn)行光密度測(cè)定，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。通過(guò)各組間兩兩比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

表2 中腦腹側(cè)背蓋區(qū)GAP－43光密度測(cè)定結(jié)果（n=6，±s）

表2 中腦腹側(cè)背蓋區(qū)GAP－43光密度測(cè)定結(jié)果（n=6，±s）

注：1）與對(duì)照組比較，P＜0.01；2）與上一組比較，P＜0.01

組別GAP－43光密度對(duì)照0.3396±0.0115 1周戒斷0.1641±0.00931）2周戒斷0.2611±0.01061）2）4周戒斷0.5984±0.02371）2）

3 討論

藥物成癮是一個(gè)復(fù)雜的生物學(xué)、心理學(xué)和社會(huì)學(xué)問(wèn)題，聯(lián)系著環(huán)境刺激和濫用毒品效應(yīng)的不良適應(yīng)性記憶被公認(rèn)為是引起毒品成癮習(xí)慣復(fù)燃和持久的主要原因[4]。腦對(duì)成癮藥物的反應(yīng)表現(xiàn)為神經(jīng)元的適應(yīng)性改變和突觸的可塑性改變，藥物成癮的持續(xù)性和牢固性正是神經(jīng)元結(jié)構(gòu)和突觸的可塑性特定模式變化的結(jié)果。

本研究選擇運(yùn)用免疫組織化學(xué)染色觀察嗎啡戒斷大鼠中腦腹側(cè)被蓋區(qū)GAP-43不同時(shí)程的表達(dá)情況，來(lái)探討GAP－43在嗎啡戒斷記憶中的作用。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中主要的多巴胺能神經(jīng)元胞體所在的核團(tuán)，和多個(gè)腦區(qū)及核團(tuán)間存在著神經(jīng)纖維聯(lián)系。中腦腹側(cè)被蓋區(qū)發(fā)出的多巴胺能神經(jīng)元投射到前額葉皮層和伏隔核，并接收來(lái)自前額葉皮層、海馬下托和杏仁核的谷氨酸能神經(jīng)元的支配。長(zhǎng)期反復(fù)地?cái)z入精神活性物質(zhì)會(huì)導(dǎo)致中腦腹側(cè)被蓋區(qū)的神經(jīng)元出現(xiàn)適應(yīng)性改變[5]，從而使得前額葉皮層內(nèi)側(cè)和伏隔核的基礎(chǔ)活動(dòng)增加。最新研究[6]表明，中腦腹側(cè)被蓋區(qū)中谷氨酸-DA的相互作用可能是可卡因引發(fā)復(fù)吸行為的基礎(chǔ)。GAP-43是神經(jīng)組織特異性磷酸蛋白，分布于神經(jīng)元、再生的施旺細(xì)胞和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞中，在神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育、突觸的形成和維持、海馬長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)、神經(jīng)元信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等過(guò)程中起重要作用。GAP-43在邊緣系統(tǒng)和聯(lián)絡(luò)區(qū)有豐富表達(dá)，而大鼠出生后大部分腦區(qū)的GAP-43及其mRNA的表達(dá)都大大降低，表明其與長(zhǎng)期記憶相關(guān)的可塑性改變有關(guān)[7]。同時(shí)有研究[8-9]表明，在突觸重塑過(guò)程中，新生發(fā)芽末梢中GAP-43含量非常高，只要突觸重建進(jìn)行，即使無(wú)軸突延伸，GAP-43的表達(dá)也會(huì)在高水平表達(dá)。而一旦重建完成，GAP-43及其mRNA含量便驟然下降，甚至消失。

本研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡戒斷大鼠中腦腹側(cè)背蓋區(qū)GAP－43的表達(dá)趨勢(shì)隨依賴時(shí)間的延長(zhǎng)表現(xiàn)為先降低后升高，且升高更為明顯。前期研究[10]發(fā)現(xiàn)，嗎啡可引起神經(jīng)元出現(xiàn)缺血缺氧及退行性改變。本研究戒斷1周組大鼠GAP－43表達(dá)降低，考慮其原因?yàn)閱岱葘?duì)神經(jīng)細(xì)胞的損傷所引起。GAP－43的活性和含量受神經(jīng)元活性控制，神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量減少和活性降低，GAP－43的表達(dá)也會(huì)隨之降低。而GAP－43又是神經(jīng)元軸突生長(zhǎng)發(fā)育和可塑性的分子標(biāo)記物，隨著戒斷時(shí)間的延長(zhǎng)，GAP－43表達(dá)升高，突觸開(kāi)始重建，提示受損的神經(jīng)元開(kāi)始修復(fù)。

嗎啡對(duì)學(xué)習(xí)記憶的影響是雙重的，一方面可以對(duì)某些類型的學(xué)習(xí)記憶造成損害，另一方面，多次給予嗎啡也可引起記憶恢復(fù)和重新鞏固[11-12]，一些不良適應(yīng)性記憶得到了加強(qiáng)。中腦腹側(cè)背蓋區(qū)在嗎啡依賴形成后，GAP－43的表達(dá)與對(duì)照組相比出現(xiàn)降低，考慮其與戒斷記憶有關(guān)。多次給予嗎啡導(dǎo)致成癮記憶得到加強(qiáng)，戒斷后GAP－43表達(dá)持續(xù)增高，也說(shuō)明GAP－43參與了戒斷記憶。而隨嗎啡對(duì)神經(jīng)細(xì)胞損害時(shí)間的延長(zhǎng)，神經(jīng)細(xì)胞的損害進(jìn)一步加重，GAP－43的表達(dá)也隨之進(jìn)一步增高，以至于超出原有水平。對(duì)于嗎啡對(duì)學(xué)習(xí)記憶的行為學(xué)影響和各腦區(qū)GAP－43的基因表達(dá)，將作進(jìn)一步的研究。

[1]Kelley AE. Memory and addiction：shared neural circuitry and molecular mechanisms[J].Neuron，2004，44（1）：161-179.

[2]Nestler EJ. Neurobiology.Total recall-the memory of addiction[J]. Science，2001，292（5525）：2266-2267.

[3]Maldonado R. Participation of noradrenergic pathways in the expression of opiate withdrawal：biochemical and pharmacological evidence[J]. Neurosci Biobehav Rev，1997，21（1）：91-104.

[4]Lee JL，Di Ciano P，Thomas KL，et al. Disrupting reconsolidation of drug memories reduces cocaine-seeking behavior[J]. Neuron，2005，47（6）：795-801.

[5]方貽儒，王祖承.谷氨酸、多巴胺、“動(dòng)機(jī)環(huán)路”與物質(zhì)依賴[J].國(guó)外醫(yī)學(xué)精神病學(xué)分冊(cè)，2004，31（2）：91-94.

[6]Sun W，Akins CK，Mattingly AE，et al. Ionotropic glutamate receptors in the ventral tegmental area regulate cocaine-seeking behavior in rats[J]. Neuropsychopharmacology，2005，30（11）：2073-2081.

[7]Akulinin VA，Belichenko PV，Dahlstrom A.The cellular distribution of GAP-43 immunoreactivity in human neocortical areas using immunofluorescence and confocal microscopy：post-ischemic influence[J]. Brain Res，1998，784（1-2）：341-346.

[8]Schmidt-Kastner R，Bedard A，Hakim A.Transient expression of GAP-43 within the hippocampus after global brain ischemia in rat[J]. Cell Tissue Res，1997，288（2）：225-238.

[9]Stroemer RP，Kent TA，Hulsebosch CE.Neocortical neural sprouting，synaptogenesis，and behavioral recovery after neocortical infarction in rats[J]. Stroke，1995，26（11）：2135-2144.

[10]朱華，李利華，楊舉倫，等.嗎啡依賴對(duì)大鼠生理性依賴相關(guān)腦區(qū)突觸數(shù)量的影響[J].解剖學(xué)雜志，2004，27（4）：394-397.

[11]Zarrindast MR，F(xiàn)arahmandfar M，Rostami P，et al. The influence of central administration of dopaminergic and cholinergic agents on morphine-induced amnesia in morphine-sensitized mice[J]. J Psychopharmacol，2006，20（1）：59-66.

[12]Zarrindast MR，Khalilzadeh A，Rezayat SM，et al. Influence of intracerebroventricular administration of histaminergic drugs on morphine state-dependent memory in the step-down passive avoidance test[J]. Pharmacology，2005，74（2）：106-112.

（本文編輯：張建華）

Expression of GAP－43 in Midbrain Ventral Tegmental Area of Morphine Withdrawal Rats

LUO Liang-ming1,2,WU Yu-feng3,NI Wei-cheng4,ZHU Hua1
（1.Department of Forensic Medicine,Wenzhou Medical College,Wenzhou 325035,China;2.Institute of Criminal Science and Technology,Wenzhou Public Security Bureau,Wenzhou 325000,China;3.Criminal Investigation Team,Zhuji Public Security Bureau,Zhuji 311800,China;4.Department of Criminal Technology,Pingyang Public Security Bureau,Pingyang 325400,China）

ObjectiveTo observe the protein expression of growth associated protein-43（GAP-43）in midbrain ventral tegmental area in morphine withdrawal rats at different time,and to evaluate the effect of GAP-43 on morphine withdrawal memory.MethodsRat models of morphine dependent 1 week,2 weeks and 4 weeks were established by morphine hydrochloride intraperitoneal injection with increasing doses to establish natural withdrawal.The protein expression of GAP-43 in midbrain ventral tegmental area was observed by immunohistochemical staining and the results were analyzed by Image-Pro Plus 5.1 image analysis system.ResultsWith prolongation of dependent time,the expression of GAP-43 was decreased then increased in midbrain ventral tegmental area.ConclusionGAP-43 could play a role in morphine withdrawal memory in midbrain ventral tegmental area.

forensic pathology;morphine dependence;growth associated protein-43;rats

DF795.1

A

10.3969/j.issn.1004-5619.2013.05.003

1004-5619（2013）05-0330-03

浙江省溫州市科技局基金資助項(xiàng)目（Y20090237）；浙江省公安廳重大科研資助項(xiàng)目（20110204）

羅良鳴（1978—），男，湖北松滋人，副主任法醫(yī)師，主要從事法醫(yī)病理學(xué)檢驗(yàn)；E-mail：wzrsmart@gmail.com

朱華，男，碩士，副教授，主要從事吸毒的毒理病理和行為學(xué)研究；E-mail：wzzhhua@163.com

2012-09-27）