賀文鳳，曹 青，洪 葵，2*

(南昌大學第二附屬醫(yī)院1．江西省分子醫(yī)學重點實驗室;2．心血管內(nèi)科，江西南昌330006)

自首次報道經(jīng)攜帶OCT4、SOX2、KLF4 及C-MYC基因的4 種反轉(zhuǎn)錄病毒共同轉(zhuǎn)染人皮膚成纖維細胞并成功建立人誘導(dǎo)多能干細胞(induced pluripotent stem cell，iPSC)系以來，有關(guān)iPSC 的研究急劇增加，目前已建立多種疾病特異的iPS 細胞系［1－3］。研究表明，直接將體細胞再程序化成為iPSC獲得患者特異的干細胞系能夠真實地再現(xiàn)疾病的發(fā)生過程，為研究疾病的發(fā)病機制、藥物篩選提供了良好的體外研究模型。另外，iPS 的遺傳學特征與其來源的體細胞一致，由其分化來的組織或器官移植到患者體內(nèi)不容易產(chǎn)生免疫排斥，因而具有實現(xiàn)個體化的優(yōu)點，從而為組織替代治療提供了獨特的機會，給再生醫(yī)學帶來了新的希望，并且避免了人胚胎干細胞帶來的倫理學問題。目前iPS 細胞來源的體細胞范圍非常廣泛，不但可以來源于成纖維細胞，還可以來源于體內(nèi)其他已經(jīng)分化的細胞。在iPS 產(chǎn)生技術(shù)上已經(jīng)利用非整合性病毒、小分子化合物或蛋白質(zhì)等新方法成功地建立了iPS 細胞系，從而有利于提高iPS 的形成效率并減低腫瘤的發(fā)生。盡管iPS 技術(shù)取得了迅速的發(fā)展，但由于細胞內(nèi)重編程過程的復(fù)雜性，使得體細胞經(jīng)過再程序化成為iPS 是一個緩慢的并且隨機發(fā)生的過程，iPS 技術(shù)上仍然存在許多需要解決的問題，從而阻礙了其實際應(yīng)用。體細胞重編程為iPSC 的難題突出表現(xiàn)在兩個方面:一方面是減少再程序化過程導(dǎo)致的細胞凋亡及衰老;另一方面是提高體細胞獲得多能性的效率。

1 線粒體的功能及其在iPSC 再程序化過程中的作用

線粒體由外膜、內(nèi)膜、膜間隙和基質(zhì)4 部分組成，具有通過電子傳遞鏈控制ATP 的產(chǎn)生、控制細胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)及細胞凋亡和信號傳導(dǎo)的功能。同時，線粒體也是導(dǎo)致DNA 氧化損傷的內(nèi)源性活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)的主要來源。線粒體具有自身的DNA，線粒體DNA 的復(fù)制由聚合酶gamma 等核因子調(diào)控，有效地控制線粒體的數(shù)量及功能對于維持細胞內(nèi)能量生成及抗氧化損傷非常重要，但由于ROS 的存在并缺乏有效的修復(fù)機制，線粒體DNA 隨細胞壽命增加易于發(fā)生突變，導(dǎo)致細胞功能障礙。線粒體參與了細胞的許多重要的生理過程，已有許多研究表明線粒體的結(jié)構(gòu)及功能對干細胞的生存、增殖、自我更新及分化潛能具有重要影響［4－6］。

2 線粒體對iPSC 再程序化過程中能量轉(zhuǎn)化的影響

含氧量正常的生理狀態(tài)下，人的體細胞以活化的線粒體及需氧代謝為特征，而胚胎干細胞則以糖酵解為能量代謝特征，糖酵解能夠提供快速的能量供應(yīng)并避免ROS 的產(chǎn)生，并通過促進戊糖磷酸旁路途徑抗氧化。早期研究表明，低氧及線粒體抑制劑能減少胚胎干細胞分化，同時維持其多能性及自我更新的能力，因而將相對非成熟的線粒體結(jié)構(gòu)及低線粒體活性作為原始胚層細胞、內(nèi)細胞團、早期胚胎及人和鼠胚胎細胞的共同特征［7］。

但是，iPSC 采用什么樣的能量代謝方式，線粒體與再程序化又有什么樣的聯(lián)系?新近研究提出了一些新思路。研究發(fā)現(xiàn)在干細胞因子重編程體細胞的過程中，線粒體也發(fā)生重編程回復(fù)到類似胚胎干細胞的狀態(tài)，由成熟的管狀嵴富集的體細胞線粒體轉(zhuǎn)變?yōu)榉浅墒烨蛐吾杖狈Φ念惻咛ジ杉毎€粒體，并具有線粒體數(shù)目少、集中分布于細胞核周圍、線粒體DNA 拷貝數(shù)少等胚胎干細胞內(nèi)線粒體的典型特征，并且發(fā)現(xiàn)糖酵解代謝有利于iPSC 處于自我更新狀態(tài)［8－10］。2011年有研究比較了ESC、iPSC 及產(chǎn)生iPSC 的相應(yīng)體細胞的能量代謝方式，并對與葡萄糖代謝相關(guān)的幾條通路的基因及調(diào)控葡萄糖代謝的關(guān)鍵蛋白進行了分析。結(jié)果表明，盡管iPSC 的代謝特征不完全與ESC 一致，但是，其與ESC 的相似性遠遠大于其相應(yīng)的體細胞［11］。同年另一研究小組在CELL 雜志發(fā)表了關(guān)于能量代謝在iPSC 產(chǎn)生中的作用，證實了體細胞經(jīng)過再程序化形成iPSC 過程中線粒體的形態(tài)變化，并通過蛋白組學足跡法及指紋法發(fā)現(xiàn)iPSC 的代謝不同于其來源的體細胞，iPSC 的葡萄糖利用增加，細胞內(nèi)外糖代謝產(chǎn)物乳酸鹽及醋酸鹽增加，能量代謝由體細胞的氧化磷酸化轉(zhuǎn)化與胚胎型一致的糖酵解代謝(圖1)。更為讓人欣喜的發(fā)現(xiàn)是在體細胞去分化的過程中，糖酵解基因在誘導(dǎo)再程序化處理后1 周表達，而多能性基因在2 周后才開始表達，刺激糖酵解能提高體細胞再程序化的效率。細胞內(nèi)糖酵解酶表達增加，電子傳遞復(fù)合體Ι 表達降低使得能量代謝模式由氧化代謝轉(zhuǎn)變?yōu)樘墙徒獯x是獲得多能性的基礎(chǔ)［12］。一些小分子或線粒體抑制劑能夠通過調(diào)節(jié)線粒體的動態(tài)平衡使線粒體被自噬體清除，使線粒體喪失，從而加速糖酵解代謝，有利于再程序化的進行［12－13］。

干細胞轉(zhuǎn)錄因子重編程體細胞獲得胚胎樣的多能性是iPSC 的標志，而體細胞的能量結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)化是成功獲得干細胞性的關(guān)鍵。線粒體與細胞的能量代謝有著密切的聯(lián)系，細胞中除糖酵解在細胞質(zhì)中進行外，其他的生物氧化過程都在線粒體中進行。作為再程序化的結(jié)果，線粒體DNA 的減少與線粒體形態(tài)的不成熟具有一致性，非線粒體依賴的代謝是體細胞再程序化的基礎(chǔ)。調(diào)節(jié)線粒體的生物合成，從而轉(zhuǎn)換細胞內(nèi)的能量代謝模式對體細胞獲得干細胞性重編程為iPSC 以及iPSC 維持自我更新和多能性是必須的。

3 線粒體對iPSC 再程序化過程中細胞衰老的影響

在體細胞內(nèi)表達4 種干細胞因子是一個造成細胞損傷的過程，這個過程有可能激活細胞衰老從而阻礙iPSC 的再程序化進程，而線粒體對其有什么樣的影響，受到什么因素的調(diào)控?

圖1 體細胞重編程為iPSC 的過程中，能量代謝由氧化磷酸化為主的方式轉(zhuǎn)化為糖酵解為主Fig 1 The energy metabolism converts from oxidative phosphorylation to glycolysis during the reprogramming

2010年Stem Cell 上有研究報道，經(jīng)過再程序化過程iPSC 的線粒體回復(fù)到類似胚胎干細胞的狀態(tài)，同時發(fā)現(xiàn)細胞內(nèi)ROS 及超氧化物陰離子水平低于其來源的成纖維細胞，其抗氧化基因的表達及抗氧化能力均高于其來源的成纖維細胞，而與人胚胎干細胞相似［14］。在同期另一篇研究也報道了iPS 細胞內(nèi)線粒體的變化，并發(fā)現(xiàn)未分化的iPS 細胞內(nèi)由ROS 損傷的蛋白質(zhì)、DNA 及脂質(zhì)水平與人胚胎干細胞相似，但明顯低于其來源的成纖維細胞，線粒體相關(guān)的氧化應(yīng)激途徑可能與iPS 細胞抵抗ROS 導(dǎo)致的細胞衰老有關(guān)［15］。

ROS 是導(dǎo)致細胞損傷及衰老的重要原因之一，而iPS 與其來源的成纖維細胞抗ROS 損傷能力的差異可能與再程序化過程導(dǎo)致的線粒體結(jié)構(gòu)、數(shù)量及功能的變化有密切的聯(lián)系，不難推論出線粒體對于iPSC再程序化過程中的細胞衰老有著重要的影響。

在正常生理狀態(tài)及特異發(fā)育階段，線粒體可以被非特異或特異的自體吞噬過程清除，自體吞噬能夠清除損傷、無功能及多余的線粒體，從而調(diào)整線粒體的數(shù)量及質(zhì)量，以適應(yīng)新的微環(huán)境需要。研究者在復(fù)制衰老模型中發(fā)現(xiàn)線粒體融合增加、巨大線粒體形成及與線粒體分裂有關(guān)的蛋白表達減少，將導(dǎo)致自體吞噬清除的線粒體減少，證實線粒體分裂狀態(tài)的維持對線粒體自體吞噬是必須的［16］。進一步研究表明，線粒體由復(fù)雜蛋白質(zhì)網(wǎng)絡(luò)精確調(diào)控其融合及分裂狀態(tài)，從而維持其在細胞內(nèi)的平衡，線粒體分裂的調(diào)節(jié)子Fisl 在衰老的細胞中下調(diào)，特異的抑制Fisl 的表達將使線粒體伸長，同時出現(xiàn)細胞體積變大、細胞折光度減低等細胞衰老的形態(tài)表現(xiàn)，過表達Fisl 將能有效逆轉(zhuǎn)線粒體伸長及細胞的衰老表型［17］。體細胞重編程為iPSC 的過程需要借助外界因素的誘導(dǎo)，外界因素一方面有可能使線粒體分裂增加而上調(diào)自體吞噬，導(dǎo)致線粒體數(shù)量及大小的顯著減少，從而有利于iPSC 再程序化進行，另一方面可能使線粒體融合增加，下調(diào)自體吞噬，從而產(chǎn)生巨大線粒體導(dǎo)致細胞衰老而阻礙iPSC 再程序化的進行。最近研究已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，一些小分子物質(zhì)及自體吞噬活化劑能使線粒體分裂增加，上調(diào)自體吞噬使線粒體數(shù)量的減少，從而提高iPS 細胞產(chǎn)生效率和速度［18］。

盡管目前有關(guān)線粒體對iPSC 再程序化過程中細胞衰老的影響不甚清楚，但不難推論，調(diào)控線粒體的狀態(tài)對減少iPSC 再程序化導(dǎo)致的細胞衰老有著重要意義。

iPS 技術(shù)已有所突破，然而對重編程的機制的研究仍處于起步階段，尤其是重編程過程中的關(guān)鍵問題目前知之甚少。細胞的重編程是一個復(fù)雜的過程，線粒體與iPSC 再程序化過程中能量代謝的轉(zhuǎn)換及細胞衰老有著密切關(guān)系，但具體的機制目前仍不清楚。線粒體對于細胞再程序化究竟有哪些作用，其作用機制是什么，如何通過調(diào)節(jié)線粒體的生物合成及線粒體狀態(tài)從而提高iPSC 的重編程效率等許多問題仍有待于去揭示。

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