成 潔，鄒麗莉，段進丹，孫 偉

(中國醫(yī)學科學院基礎醫(yī)學研究所北京協(xié)和醫(yī)學院基礎學院中心實驗室，北京100005)

目前應用質譜進行蛋白質組研究需要將蛋白質酶切成多肽片段，再進行質譜分析，通過數(shù)據(jù)庫檢索實現(xiàn)蛋白質組的大規(guī)模鑒定［1］。但是在這個過程中，傳統(tǒng)酶切法耗時長，往往需要16 h以上，極大的限制了蛋白質組分析的通量。超聲輔助酶切法利用超聲波輔助進行酶切，可以在幾分鐘內實現(xiàn)蛋白質的酶切，明顯縮短了酶切的時間，增加了蛋白質組學研究的通量，是目前新開發(fā)的一種蛋白質快速酶切方法。雖然許多文獻報道了應用超聲輔助蛋白質組樣品進行酶切［2－4］，但超聲輔助酶切法的優(yōu)缺點，尤其是其所得到的多肽特性還有待進一步研究。本研究結合膜輔助溶液內酶切［5］，通過與傳統(tǒng)過夜酶切法比較，闡述超聲輔助酶切法對溶液內蛋白質樣品的酶切特點。

1 材料與方法

1.1 試劑

二硫蘇糖醇(Dithiothreitol，DTT)、碘乙酰胺(Iodoacetamide，IAA)和血管緊張素Ⅱ(Sigma 公司);質譜級胰蛋白酶(Promega 公司);色譜級乙腈、甲酸、三氟乙酸和碳酸氫氨(Merk 公司);氯化鈉，乙醇，鹽酸等(北京化學試劑公司)。牛血清白蛋白(Bovine serum albumin，BSA)(北京鼎國生物技術有限公司)。

1.2 蛋白質酶切

本實驗應用標準蛋白BSA 進行兩種方法的比較，兩種酶切方法分別重復3 次，結果用均數(shù)±標準差(±s)表示。BSA 以1 g/L溶于裂解液(7 mol/L尿素，2 mol/L 硫脲，65 mmol/L DTE，100 mmol/L Tris)中。兩支10 ku套管分別取200 μg BSA，加入DTT 使其終濃度為20 mmol/L，37 ℃水浴1 h，離心除去液體并用UA(8 mol/L 尿素，0.1 mol/L Tris/HCl pH 8.5)清洗樣品;加入50 mmol/L IAA 溶液，室溫避光45 min，離心除去液體并用UA 沖洗后，加入200 μL 25 mmol/L碳酸氫銨，以1∶20的比例加入胰蛋白酶，分別用傳統(tǒng)過夜酶切法和超聲輔助酶切法進行酶切［5］。傳統(tǒng)過夜酶切法將樣品置于37 ℃水浴13 h后，再以1∶50比例加入胰蛋白酶，繼續(xù)水浴3 h后完成酶切。超聲輔助酶切法用2 mm超聲破碎儀探頭伸入溶液中進行酶切，超聲功率20 W，工作時間60 s，暫停30 s，兩個循環(huán)后，再以1∶50比例加入胰蛋白酶，超聲兩個循環(huán)，完成酶切(表1)。得到的多肽用C18 柱萃取后真空抽干。

表1 傳統(tǒng)過夜酶切法和超聲輔助酶切法的比較Table 1 The comparison of overnight and ultrasoundassisted digestion methods

1.3 多肽濃度的檢測

酶切后的多肽樣品重溶于1‰甲酸后應用BCA法測定多肽濃度。血管緊張素II 配成1、0.5、0.25、0.1、0.05 及0 g/L的標準品，將10 μL不同的濃度的標準品及多肽樣品分別加入96 孔板中，再加入200 μL配好的工作液，顯色后測其在波長562 的吸光度。根據(jù)標準品的濃度及其相應的吸光度值制作濃度/吸光度標準曲線，計算出樣品濃度。

1.4 一維膠分離

酶切前后BSA 樣品加入還原劑和上樣緩沖液，在100 ℃條件下加熱5 min，應用4% ～12% SDS 膠分離，恒壓200 V，時間為35 min。應用微波輔助方法進行考馬斯亮藍染色［6］，Alpha 凝膠成像系統(tǒng)成像。

1.5 質譜分析

將1 μL酶解液點入384 孔MALDI-TOF 靶中，待樣品自然干燥后，加入a-Cyano-4-hydroxycin-namie acid 飽和溶解基質(70% ACN，0.1% TFA)，同時在校準點內加入已知質量數(shù)的多肽混合物作為外標校準物。質譜方法采用反射正離子模式，20 KV加速電壓，激光強度為1%，掃描質量范圍0.5 ～3.5 ku。所得質譜圖用MASCOT(V2.3.02)軟件檢索，所用數(shù)據(jù)庫為牛的蛋白質數(shù)據(jù)庫(ftp．ncbi．nih．gov/)。檢索參數(shù)為:胰蛋白酶，誤切位點為2，母離子質量誤差為50 ppm，固定修飾為脲甲基化修飾Carbamidomethy(C)，可變修飾為氨基甲?；揎桟arbamy(N-term)。

2 結果

2.1 傳統(tǒng)過夜酶切法與超聲輔助酶切法的多肽回收率

傳統(tǒng)過夜法的多肽回收率為47% ±3.9%，超聲輔助酶切法的多肽回收率為39% ±2.7%，較傳統(tǒng)酶切法低8%。

2.2 傳統(tǒng)過夜酶切法與超聲輔助酶切法酶切后一維膠結果

酶切前后的BSA 樣品應用SDS 膠進行分離，結果顯示兩種方法酶切后的條帶相似，在BSA 位置的蛋白條帶消失，在3.5 ku附近出現(xiàn)了酶切后的多肽條帶(圖1)。

2.3 傳統(tǒng)過夜酶切法與超聲輔助酶切法酶切后飛行時間質譜結果

兩種方法酶切得到的肽段進行了基質輔助激光飛行時間質譜儀分析。圖2A 與圖2B 圖分別為兩種方法得到的BSA 肽指紋圖譜。用MASCOT 軟件對質譜圖進行了數(shù)據(jù)庫檢索，結果顯示(表2)，超聲輔助酶切法相比于傳統(tǒng)過夜酶切法的MASCOT 評分高122.8%，匹配的多肽數(shù)多47.7%，肽段的覆蓋率高10%，誤切率高22%。

2.4 傳統(tǒng)過夜法與超聲輔助酶切法酶切后多肽特征的分析

圖1 傳統(tǒng)過夜法與超聲輔助酶切法酶切BSA前后一維膠結果Fig 1 One-dimensional gel of BSA before and after digestion using overnight and ultrasoundassisted methods

將在3 次重復實驗中均得到鑒定的多肽進行分析(表3)，傳統(tǒng)過夜酶切法3 次重復鑒定的多肽有36 個，超聲輔助酶切法有49 個，兩種方法共有的多肽為28 個(圖3A)，超聲輔助酶切法得到的多肽比過夜酶切法多13 個，并包含了過夜酶切法匹配肽中78%的肽段。

圖2 兩種酶切方法飛行時間質譜結果Fig 2 The MALDI-TOF mass spectra of BSA from overnight and ultrasound-assisted methods

表2 兩種方法所得到的質譜鑒定結果Table 2 The MS results from overnight and ultrasound-assisted methods(±s，n=3)

表2 兩種方法所得到的質譜鑒定結果Table 2 The MS results from overnight and ultrasound-assisted methods(±s，n=3)

＊P＜0.01 compared with control．

methodmascot scoreNo．of peptidesSequence coverage (%) miscleavage peptide rate (%)overnight digestion101 ±28*42 ±5*71% ±6%38% ±9%*ultrasound-assisted digestion225 ±16*62 ±5*81% ±4%60% ±5%*

對兩種方法共57個多肽的誤切位點的分析表明(圖3B)，共有的28 個肽段誤切率為29%，只被過夜酶切法鑒定的多肽誤切率為37%，只被超聲輔助酶切法鑒定的多肽誤切率為95%，明顯高于過夜酶切法。

對上述57 個多肽的分子量(圖3C)及多肽長度(圖3D)分布情況分析表明，在分子質量小于2 ku、長度小于20 個氨基酸時，兩種方法得到的肽段數(shù)目無明顯差別。但在分子質量大于2 ku和長度大于20 個氨基酸時，超聲法獲得的肽段數(shù)量明顯高于傳統(tǒng)方法，而且這些肽段大多有胰蛋白酶的誤切位點。

圖3 兩種方法得到多肽性質分析Fig 3 The analysis of peptides from two methods

3 討論

超聲輔助酶切法是利用超聲波進行快速酶切的一種方法，其可以明顯加快蛋白質的酶解過程，提高蛋白質組學的分析速度。雖然其具體工作原理還不清楚，但其酶切效果得到了眾多研究成果的證實。目前這方面的應用研究很多，但超聲輔助酶切法對溶液內蛋白質樣品的酶切優(yōu)缺點，尤其是鑒定出多肽的特點還沒有報導，因此本文通過與過夜酶切法方法的比較，闡述了其酶切的特點。

本研究通過對標準蛋白BSA 溶液內樣品的酶切，證明超聲輔助酶切法可以在10 min之內完成酶切。通過質譜分析結果表明，其酶切出的多肽數(shù)要高于過夜酶切法，因此得到了更高的MASCOT 得分和蛋白覆蓋率，說明超聲輔助酶切法可以得到更好的質譜鑒定結果，上述結論與以往報導相一致。

進一步對其鑒定出的多肽性質分析表明，超聲輔助酶切法得到的多肽誤切率明顯高于傳統(tǒng)過夜酶切法，而且比過夜酶切法多鑒定出的多肽大多含有誤切位點，說明該方法酶切不完全，其可以得到更多的多肽和更高的蛋白質覆蓋率是由不完全酶切造成的，這也可以部分解釋其酶切后多肽的回收率要低于傳統(tǒng)過夜酶切法。

在蛋白質組學應用中，應用超聲輔助酶切法可以得到更多的肽段和更高的蛋白質覆蓋率，因此可以用于發(fā)現(xiàn)蛋白質組學的分析，可以鑒定到更多的蛋白或多肽，尤其是一些低豐度蛋白或用傳統(tǒng)過夜方法難以酶切的蛋白。另一方面，超聲輔助酶切法對蛋白質的酶切不完全，會增加樣品的復雜程度，增加靶向分析的多肽檢測難度，因此不太適用于靶向蛋白質組學分析。

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