夏長(zhǎng)勝，劉 暢，孫媛媛，龍 彥，趙曉濤

(北京大學(xué)人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京100044)

人CYP2C19(cytochrome P450 2C19)是細(xì)胞色素氧化酶P450 的主要成分之一，代謝一系列臨床上常用藥物，活性存在顯著的個(gè)體差異，表現(xiàn)為血藥濃度的個(gè)體差異。CYP2C19 基因具有遺傳多態(tài)性，野生型為CYP2C19* 1/* 1 型，CYP2C19* 2 型和CYP2C19* 3 型是中國(guó)人群中最常見(jiàn)的兩種等位基因型［1］。CYP2C19* 2 型為CYP2C19 基因第5 外顯子681G ＞A 點(diǎn)突變，導(dǎo)致剪接缺陷［2］;CYP2C19* 3型為第4 外顯子636G ＞A 點(diǎn)突變，提前產(chǎn)生終止密碼子［3］。這些點(diǎn)突變引起CYP2C19 基因編碼的酶活性喪失，代謝底物的能力減弱，使血藥濃度增高，從而引起與血藥濃度相關(guān)的藥物不良反應(yīng)。一般攜帶2 個(gè)無(wú)功能等位基因者稱(chēng)為弱代謝者，中國(guó)人群中的弱代謝型99%以上為* 2 型純合子、* 3 型純合子及* 2/* 3 型雜合子［1］。CYP2C19 基因分型檢測(cè)結(jié)果可用于氯吡格雷、磺脲類(lèi)藥物及其他相關(guān)代謝藥物的個(gè)體化給藥指導(dǎo)。

本研究擬使用“等位基因特異PCR”結(jié)合熒光探針技術(shù)，檢測(cè)CYP2C19 基因第5 外顯子681 位點(diǎn)和第4 外顯子636 位點(diǎn)的核苷酸類(lèi)型，判斷CYP2C19 基因型，從而了解人群中CYP2C19 基因型的分布，同時(shí)使用金標(biāo)準(zhǔn)DNA 直接測(cè)序法評(píng)價(jià)熒光PCR 法檢測(cè)結(jié)果。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

人CYP2C19 基因分型檢測(cè)試劑盒(熒光PCR法)(蘇州曠遠(yuǎn)生物分子技術(shù)公司);血液基因組提取試劑盒(天根生化科技公司)。

1.2 研究對(duì)象

選擇臨床剩余外周靜脈EDTA-K2抗凝全血標(biāo)本，試驗(yàn)樣本供者的性別年齡不限。樣本排除標(biāo)準(zhǔn):有輸血史，骨髓移植史的患者血液樣本。共收集356 例樣本，其中男性145 例，女性211 例。本實(shí)驗(yàn)獲得北京大學(xué)人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。研究所用標(biāo)本為受試者在診療中正常采集樣本的剩余樣本，非為臨床試驗(yàn)特意提供，檢測(cè)結(jié)果不作為臨床診斷依據(jù)，病人姓名用編號(hào)代替，受試者權(quán)益、安全和隱私能夠得到充分保障?；谏鲜鲈?，不需與受試者簽署知情同意書(shū)。

1.3 核酸提取

取300 μL EDTA-K2抗凝全血，提取基因組DNA，最后溶于50 μL洗脫液。如在24 h內(nèi)檢測(cè)，于2 ～8 ℃保存，否則－20 ℃以下保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 PCR 熒光法檢測(cè)CYP2C19 基因型

按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作，對(duì)每份標(biāo)本采用4 管獨(dú)立的PCR 反應(yīng)體系，即采用CYP2C19 2G、2A、3G 及3A PCR 反應(yīng)液分別檢測(cè)CYP2C19 681G＞A 和636G ＞A 點(diǎn)突變，使用ROX 標(biāo)記的內(nèi)參探針對(duì)PCR 反應(yīng)結(jié)果進(jìn)行質(zhì)量控制，同時(shí)每種PCR反應(yīng)液均做陽(yáng)性對(duì)照(相應(yīng)質(zhì)控品作為模板)及空白對(duì)照(不加模板)。PCR 反應(yīng)總體系為25 μL，其中PCR 反應(yīng)液23 μL，反應(yīng)酶1 μL，模板1 μL。實(shí)時(shí)PCR 反應(yīng)在LightCycler 480ⅡPCR 儀上進(jìn)行。反應(yīng)條件:去污染37 ℃2 min;預(yù)變性95 ℃3 min;95 ℃20 s，58 ℃30 s，65 ℃45 s，10 個(gè)循環(huán);95 ℃20 s，58 ℃30 s設(shè)置Fam 及Rox 雙通道采集熒光信號(hào)，65 ℃45 s，30 個(gè)循環(huán);冷卻25 ℃1 min。

結(jié)果分析:4 種質(zhì)控品檢測(cè)反應(yīng)體系內(nèi)的目的檢測(cè)熒光信號(hào)和內(nèi)參熒光信號(hào)形成的擴(kuò)增曲線(xiàn)，其循環(huán)閾值(threshold cycle，Ct)均應(yīng)≤23;否則反應(yīng)體系異常。4 種反應(yīng)液的空白對(duì)照反應(yīng)體系，應(yīng)無(wú)擴(kuò)增信號(hào)或者擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct ＞23，若空白對(duì)照反應(yīng)體系的擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct≤23，則反應(yīng)體系異常。樣本基因型判斷參考值:對(duì)于DNA 樣本的4 種檢測(cè)反應(yīng)體系，其內(nèi)參擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct 值均應(yīng)≤23，如果內(nèi)參Ct 值＞23，則反應(yīng)體系異常。在內(nèi)參擴(kuò)增曲線(xiàn)的Ct 值正常的情況下，目的檢測(cè)信號(hào)的擴(kuò)增曲線(xiàn)Ct 值≤23，則為陽(yáng)性，否則為陰性?；蚍中团袛嘁?jiàn)表1。

表1 熒光PCR 法檢測(cè)CYP2C19 基因型Table 1 CYP2C19 genotyping by fluorescent PCR

1.5 DNA 測(cè)序法檢測(cè)CYP2C19 基因型

DNA 直接測(cè)序(Sanger 測(cè)序法)檢測(cè)CYP2C19基因型由北京六合華大基因科技股份有限公司提供服務(wù)。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

應(yīng)用SPSS16.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。采用McNemar-Bowker(配對(duì)卡方)檢驗(yàn)分析兩種方法有無(wú)顯著性差異。計(jì)算Kappa(K)值;K 值的判定:K ＞0.75，一致性好;0.40≤K≤0.75，一致性較好;K＜0.4，一致性差。

2 結(jié)果

DNA 直接測(cè)序法檢測(cè)結(jié)果示例見(jiàn)圖1 ～2。CYP2C19 基因型檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)表2。CYP2C19 * 1/* 1型、CYP2C19* 1/* 2 型、CYP2C19* 2/* 3 型、CYP2C19* 3/* 3 型、CYP2C19* 2/* 2 型及CYP2C19* 1/*3 型的頻率分布:使用熒光PCR 法檢測(cè)時(shí)分別為46.6% (166/356)、33.2% (118/356)、2.0% (7/356)、0.8% (3/356)、10.7% (38/356)及6.7%(24/356);采用DNA 直接測(cè)序法時(shí)分別為46.3%(165/356)、33.4% (119/356)、2.0% (7/356)、0.8% (3/356)、11.0% (39/356)及6.5% (23/356)。兩種方法檢測(cè)CYP2C19 基因型具有一致性(P=0.392)，且一致性較好(K =0.987);兩種方法基因型檢測(cè)結(jié)果一致率為99.2%。人群中弱代謝型包括CYP2C19* 2/* 2 型、CYP2C19* 2/* 3 型及CYP2C19* 3/* 3 型，此3 種基因型約占13.5% ～13.8%。CYP2C19* 1、* 2 及* 3 等位基因頻率分別為66.6%、28.2%及5.2%(熒光PCR 法)，分別為66.3%、28.7%及5.0%(DNA 測(cè)序法)。

表2 二種方法檢測(cè)CYP2C19 基因型結(jié)果Table 2 The results of CYP2C19 genotypes by two methods

3 討論

迄今已知34 個(gè)CYP2C19 等位基因(http://www．cypalleles．ki．se/cyp2c19．htm)獲得確定。本研究使用等位基因特異熒光PCR 法和DNA 直接測(cè)序法對(duì)CYP2C19 基因636 及681 位點(diǎn)核苷酸的多態(tài)性進(jìn)行檢測(cè)，即檢測(cè)了CYP2C19* 1、* 2 及* 3三種等位基因。結(jié)果顯示人群中弱代謝型包括CYP2C19* 2/* 2 型、CYP2C19 * 2/* 3 型及CYP2C19* 3/* 3 型，約占13.5% ～13.8%。由于CYP2C19 基因多態(tài)性和民族及地域相關(guān)，此前國(guó)內(nèi)一項(xiàng)研究表明漢族和白族的CYP2C19 弱代謝型分別占19.8%及13.4%［1］。本研究未對(duì)民族信息進(jìn)行相關(guān)分析，或許是結(jié)果同此前研究有差異的原因。另有研究表明高加索人中CYP2C19 弱代謝型僅占3% ～5%，而亞洲人中CYP2C19 弱代謝型占13% ～23%［4］。弱代謝型肝藥酶CYP2C19 的活性喪失，從而影響一系列由其代謝的藥物的藥效。由于亞洲人群中CYP2C19 弱代謝型占比較高，為保障臨床相關(guān)藥物安全使用，如氯吡格雷、磺脲類(lèi)藥物等的個(gè)體化給藥指導(dǎo)，臨床實(shí)驗(yàn)室宜盡早開(kāi)展CYP2C19 基因型的檢測(cè)。

人CYP2C19 基因的多態(tài)性為先天遺傳，后天的疾病不會(huì)改變?cè)摶蛐?，也與性別和年齡無(wú)關(guān)。臨床檢測(cè)僅需抽取2 mL左右外周血標(biāo)本即可進(jìn)行。CYP2C19 基因636 和681 位點(diǎn)核苷酸的多態(tài)性檢測(cè)，屬于定性檢測(cè)?；蚨鄳B(tài)性檢測(cè)的分子生物學(xué)方法包括PCR-RFLP(限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析)［1，3，5－7］、DNA 直接測(cè)序［8］、單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析［9］、等位基因特異PCR［10］以及基因芯片技術(shù)等［11］。但這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力，難以用于臨床常規(guī)檢測(cè)。熒光PCR 法檢測(cè)具有高靈敏性、高特異性、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判斷簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，便于臨床常規(guī)檢測(cè)使用［12］。本研究應(yīng)用等位基因特異熒光PCR 技術(shù)檢測(cè)CYP2C19 基因636 和681 位點(diǎn)核苷酸的多態(tài)性，與DNA 直接測(cè)序法測(cè)得結(jié)果相比，兩者基因型總符合率為99.2%，有較高的一致性，僅少數(shù)樣本存在差異。分析不一致的原因可能是由于熒光PCR 法的靈敏度極高，特異引物擴(kuò)增結(jié)果不完全特異從而導(dǎo)致誤判結(jié)果;或是操作過(guò)程出現(xiàn)失誤，此情況可通過(guò)重新檢測(cè)糾正錯(cuò)誤。

總之，本研究顯示國(guó)內(nèi)北京地區(qū)人群CYP2C19弱代謝型約占13.5% ～13.8%，臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)開(kāi)展CYP2C19 基因型檢測(cè)以保障用藥安全;等位基因特異熒光PCR 技術(shù)檢測(cè)CYP2C19 基因型簡(jiǎn)便可靠。

［1］Xiao ZS，Goldstein JA，Xie HG，et al．Differences in the incidence of the CYP2C19 polymorphism affecting the Smephenytoin phenotype in Chinese Han and Bai populations and identification of a new rare CYP2C19 mutant allele［J］．J Pharmacol Exp Ther，1997，281:604－609．

［2］De Morais SM，Wilkinson GR，Blaisdell J，et al．Identification of a new genetic defect responsible for the polymorphism of (S)-mephenytoin metabolism in Japanese［J］．Mol Pharmacol，1994，46:594－598．

［3］de Morais SM，Wilkinson GR，Blaisdell J，et al．The major genetic defect responsible for the polymorphism of S-mephenytoin metabolism in humans［J］．J Biol Chem，1994，269:15419－15422．

［4］Goldstein JA，de Morais SM．Biochemistry and molecular biology of the human CYP2C subfamily［J］．Pharmacogenetics，1994，4:285－299．

［5］Zuo J，Xia D，Jia L，et al．Genetic polymorphisms of drugmetabolizing phase I enzymes CYP3A4， CYP2C9，CYP2C19 and CYP2D6 in Han，Uighur，Hui and Mongolian Chinese populations［J］．Pharmazie，2012，67:639－644．

［6］Yin SJ，Ni YB，Wang SM，et al．Differences in genotype and allele frequency distributions of polymorphic drug metabolizing enzymes CYP2C19 and CYP2D6 in mainland Chinese Mongolian，Hui and Han populations［J］．J Clin Pharm Ther，2012，37:364－369．

［7］Zuo LJ，Guo T，Xia DY，et al．Allele and genotype frequencies of CYP3A4，CYP2C19，and CYP2D6 in Han，Uighur，Hui，and Mongolian Chinese populations［J］．Genet Test Mol Biomarkers，2012，16:102－108．

［8］Kidd RS，Curry TB，Gallagher S，et al．Identification of a null allele of CYP2C9 in an African-American exhibiting toxicity to phenytoin［J］．Pharmacogenetics，2001，11:803－808．

［9］Itoh K，Inoue K，Nakao H，et al．Polymerase chain reaction-single-strand conformation polymorphism based determination of two major genetic defects responsible for a phenotypic polymorphism of cytochrome P450 (CYP)2C19 in the Japanese population［J］．Anal Biochem，2000，284:160－162．

［10］Kim M，Kong E．Genetic polymorphisms of cytochrome P450 2C19 in functional dyspeptic patients treated with cimetidine［J］．Korean J Physiol Pharmacol，2012，16:339－342．

［11］Park DK，Park HJ，Lee CY，et al．Nanogap-based electrical PNA chips for the detection of genetic polymorphism of cytochrome P450 2C19［J］．J Nanosci Nanotechnol，2012，12:5155－5159．

［12］Borlak J，Thum T．Identification of major CYP2C9 and CYP2C19 polymorphisms by fluorescence resonance energy transfer analysis［J］．Clin Chem，2002，48:1592－1594．