王全志，楊 旸，陳惠軍，楊廷桐*

(1.中國人民解放軍第371 中心醫(yī)院檢驗病理科，河南新鄉(xiāng)453003;2.南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院介入科，廣東廣州510515;3.新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院附屬新鄉(xiāng)市中心醫(yī)院內(nèi)兒康復(fù)科，河南新鄉(xiāng)453000)

心肌缺血導(dǎo)致心肌細(xì)胞功能嚴(yán)重障礙［1］，一旦心肌梗死發(fā)生后，細(xì)胞外基質(zhì)(extracellularmatrix，ECM)異常在心室重構(gòu)中發(fā)揮著重要作用。藥物干預(yù)對ECM 的影響機(jī)制目前仍有爭議，有研究［2］認(rèn)為降低基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases)/基質(zhì)金屬蛋白酶抑制因子(matrix metalloproteinase inhibitor)的比值對ECM 有影響，可以減輕肺纖維化;但也有否認(rèn)觀點［3］。因此，本研究建立大鼠心肌梗死模型，觀察螺內(nèi)脂對大鼠心肌非梗死區(qū)MMP/TIMP 失衡的影響及其可能機(jī)制，為臨床防治心肌梗死提供新思路和可能的基因治療靶點。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 心肌梗死模型建立［4］與實驗分組:60 只清潔級雄性Wistar 大鼠，12 ～15 周齡，體質(zhì)量210 ～230 g，(河南省實驗動物中心，scxk 豫2005-0001)。模型制備參照文獻(xiàn)［1］。將術(shù)后48 h存活的大鼠分為1)對照組;2)心肌梗死組;3)心肌梗死+藥物組，每組20 只。心肌梗死+藥物組48 h采用灌胃法給螺內(nèi)酯［20 mg/(kg·d)］。對照組與心肌梗死組均喂等容量0.9%氯化鈉注射液。

1.1.2 取材:3 組分別于心肌梗死模型成功后的48 h、7、14 及28 d取材，每組各時間點分別取5 只大鼠。用3%戊巴比妥鈉腹腔麻醉，迅速開胸，取出心臟，冰上操作，4 ℃經(jīng)高壓處理的DEPC 水中洗去殘余血液。剪取左室非梗死區(qū)心肌組織約100 mg分成兩塊，一塊置于液氮速凍后，于－80 ℃冰箱保存。按照Trizol (Gibco 公司)說明書提取總RNA，溶于20 μL DEPC 處理水中，用于反轉(zhuǎn)錄PCR(RTPCR)。另一塊用于HE 染色和免疫組化(IHC)分析。

1.1.3 試劑:MMP-2、MMP-9、TIMP-2 免疫組化試劑盒(武漢博士德和北京中杉試劑公司)。

1.1.4 引物合成:由上海生物工程公司合成。MMP-2 引物序列(400 bp):上游:5'-CCATGTGTCT TCCCCTTCAC-3'，下游:5'-CGATGCCATCAAAGAC AATG-3';MMP-9 引物序列(486 bp):上游:5'-GCC GGGAACGTATCTGGAAAT-3'，下游引物:5'-TCACC CGGTTGTGGAAACTC-3';TIMP-2 引物序列(442 bp):上游:5'-TCTTTCATCATGAGGCAGAGG-3'，下游:5'-GGAAGGGATGTCAAAGCTGGA-3'。大鼠β-actin 引物序列(375 bp):上游:5'-GCCATGTACGTAGCC ATCCA-3'，下游5'-GAACCGCTCATTGCCGATAG-3'。

1.2 方法

1.2.1 IHC 方法:按試劑盒說明書進(jìn)行，設(shè)置陽性及陰性對照。陽性表達(dá)為胞質(zhì)內(nèi)棕黃色。采用圖像分析軟件系統(tǒng)進(jìn)行分析，每個樣本選取5 張切片，每張切片在400 倍光鏡下選取3 個視野進(jìn)行測量，計算出平均吸光度值(average absorbance value)。

1.2.2 RT-PCR:按照試劑盒說明書進(jìn)行。采用Trizol 一步法提取總RNA，取1 μL 總RNA 以10 μL體系反轉(zhuǎn)錄制備cDNA，稀釋30 倍置于－20 ℃冰箱中備用。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)體系為25 μL:cDNA 2 μL，引物10 μmol/L，Taq 酶1.25 U。反應(yīng)條件:94 ℃預(yù)變性3 min，94 ℃35 s，62 ℃40 s，72 ℃1 min，30 個循環(huán)，72 ℃5 min，4 ℃保存。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

采用SSPS12.0 統(tǒng)計軟件，數(shù)據(jù)用目的基因/βactin 吸光度值表示，平均吸光度值用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用t 檢驗。

2 結(jié)果

2.1 心肌梗死動物模型建立成功標(biāo)志

心電圖改變及心臟大體出現(xiàn)心尖部暗紅色梗死區(qū)。

2.2 IHC 結(jié)果

梗死組MMP-2、MMP-9 活性增強(qiáng)，在14 d達(dá)到高峰(P＜0.01)，28 d有回降但仍高于對照組(P＜0.05)。梗死+藥物組中MMP-2 及MMP-9 的活性較對照組高，但比梗死組下降(P＜0.05)。而梗死+藥物組在48 h顯著高與對照組(P＜0.05)，(表1，圖1)。

2.3 非梗死區(qū)MMP-2、MMP-9 及TIMP-2 基因的表達(dá)

MMP-2、MMP-9 及TIMP-2 基因改變與蛋白表達(dá)基本一致(表2，圖2)。

3 討論

心肌梗死發(fā)生后ECM 的變化對心肌預(yù)后重構(gòu)具有重要作用［5］，MMP 與TIMP 參與了ECM 的改變。心肌細(xì)胞的再生隨時間演進(jìn)而迅速消失［6］，因此，心肌梗死后膠原蛋白的成分降解和增長就成為心室重構(gòu)的病理基礎(chǔ)。抑制心肌組織中MMP-2 和MMP-9 可以進(jìn)一步改善心臟功能［7］，由此可見MMPs/TIMP 的比值在ECM 的變化中起決定性作用。

表1 MMP-2、MMP-9 及TIMP-2 蛋白在大鼠心肌非梗死區(qū)的表達(dá)Table 1 Expression of MMP-2、MMP-9 and TIMP-2 in myocardial noninfarct area of rat(positive area/total area ×100%，±s，n=20)

表1 MMP-2、MMP-9 及TIMP-2 蛋白在大鼠心肌非梗死區(qū)的表達(dá)Table 1 Expression of MMP-2、MMP-9 and TIMP-2 in myocardial noninfarct area of rat(positive area/total area ×100%，±s，n=20)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control;#P＜0.05 compared with infarction．

groupprotein48 hours7 days14 days28 days controlMMP-26.25 ±0.426.37 ±0.516.02 ±0.436.01 ±0.16 MMP-95.56 ±0.125.67 ±0.295.68 ±0.135.59 ±0.46 TIMP-29.56 ±0.178.86 ±1.289.62 ±1.639.11 ±1.46 infarctionMMP-210.36 ±1.03*16.62 ±1.35*21.29 ±1.52＊＊16.60 ±1.46*MMP-99.86 ±1.1315.42 ±1.15*20.89 ±1.42＊＊15.76 ±1.64*TIMP-210.86 ±1.63*15.42 ±1.75*23.21 ±1.12＊＊21.78 ±1.74＊＊infarction+drugMMP-29.68 ±1.7113.25 ±1.43#15.19 ±1.56#11.49 ±1.31#MMP-98.28 ±1.3312.27 ±1.33#14.58 ±1.46#10.46 ±1.63#TIMP-211.21 ±1.4318.27 ±1.63#25.18 ±1.56#22.76 ±1.63

圖1 2 周時MMP-2、MMP-9 和TIMP-2 免疫組化染色(×200)Fig 1 MMP-2、MMP-9 and TIMP-2 immunohistochemisty staining 2 weeks (×200)

表2 MMP-2、MMP-9 和TIMP-2 在非梗死區(qū)不同時間段的表達(dá)Table 2 Expression of MMP-2，MMP-9 and TIMP-2 mRNA in noninfarcted area at different time(±s，n=20)

表2 MMP-2、MMP-9 和TIMP-2 在非梗死區(qū)不同時間段的表達(dá)Table 2 Expression of MMP-2，MMP-9 and TIMP-2 mRNA in noninfarcted area at different time(±s，n=20)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 compared with control group;#P＜0.05 compared with Infarction group．

groupprotein48 hours7 days14 days28 days controlMMP-20.09 ±0.000.09 ±0.010.09 ±0.010.09 ±0.01 MMP-90.09 ±0.010.09 ±0.010.09 ±0.020.09 ±0.02 TIMP-20.11 ±0.180.10 ±0.380.09 ±0.230.11 ±0.87 infarctionMMP-20.11 ±0.02*0.15 ±0.02*0.23 ±0.01＊＊0.22 ±0.02*MMP-90.11 ±0.010.16 ±0.02*0.24 ±0.01＊＊0.21 ±0.02*TIMP-20.28 ±0.03*0.31 ±0.09*0.29 ±0.06＊＊0.28 ±0.02＊＊infarction+drugMMP-20.11 ±0.010.14 ±0.020.17 ±0.02#0.15 ±0.02#MMP-90.12 ±0.020.15 ±0.020.18 ±0.02#0.15 ±0.02#TIMP-20.29 ±0.040.46 ±0.05#0.31 ±0.03#0.29 ±0.04

圖2 2 周時大鼠非梗死中MMP-2、MMP-9、TIMP-2 mRNA RT-PCR 結(jié)果Fig 2 Result of MMP-2，MMP-9 and TIMP-2 mRNA RT-PCR of myocardial noninfarct area in rat 2 weeks

本研究動態(tài)觀察了心肌梗死發(fā)生發(fā)展過程中MMP-2、MMP-9 及TIMP-2 的變化。在對照組中MMP-2、MMP-9 及TIMP-2 均有表達(dá)。在梗死組中MMP-2、MMP-9 表達(dá)迅速增加，而TIMP-2 表達(dá)增加速度遲緩，導(dǎo)致MMP-2、MMP-9 與TIMP-2 比值失調(diào)，心肌組織被破壞。引起心肌梗死后發(fā)生心室重構(gòu)的主要時間點是在14 ～28 d以內(nèi)。臨床上應(yīng)嚴(yán)密關(guān)注此期的心臟變化。而在28 d以后TIMP-2 逐漸升高，對MMP-2、MMP-9 起到一定抑制作用。

本研究進(jìn)一步說明MMP-2 與MMP-9 明顯升高嚴(yán)重影響了心功能。而MMP-2 轉(zhuǎn)基因小鼠模型能夠獨立引起心室重塑和心功能不全［8］，則為MMPs與心室重塑的關(guān)系提供了更確切的證據(jù)。

螺內(nèi)酯屬于醛固酮拮抗劑，可降低心肌梗死后心力衰竭和重度心力衰竭的死亡率［7］，顯示了拮抗醛固酮對心臟毒害作用的重要性和醛固酮拮抗劑在治療心力衰竭中的地位。螺內(nèi)酯與氯沙坦及其聯(lián)合治療均可顯著降低非梗死區(qū)心肌膠原沉積及I/Ⅲ型膠原比值，抑制膠原的增生［9］。然而，在心肌梗死后的心室重構(gòu)中，醛固酮拮抗劑對非梗死區(qū)膠原重構(gòu)的影響是否與MMPs/TIMP 的比值有關(guān)，尚不清楚。本實驗發(fā)現(xiàn)梗死+藥物組中MMP-2及MMP-9 的表達(dá)在同一時間點上比梗死組顯著降低，提示螺內(nèi)酯可以降低MMP-2 及MMP-9 的表達(dá)，升高TIMP-2 的表達(dá)，減輕心肌梗死時由于ECM 的破壞而導(dǎo)致嚴(yán)重的心肌破壞與重構(gòu)。螺內(nèi)酯抑制心肌梗死后的心室重構(gòu)可能是通過調(diào)節(jié)MMPs/TIPMP 的比值起作用［10］。

本研究也發(fā)現(xiàn)TIMP-2 在梗死組的各個時間點也增高，可能的機(jī)制是TIMP-2 與MMP-2 存在共有AP-2 反式作用因子［11］。在梗死+藥物組中TIMP-2表達(dá)在各個時間點與梗死組相比有輕度增高，說明螺內(nèi)酯對TIMP-2 也有直接或間接的作用。MMP-2及MMP-9 的表達(dá)和活性過度增強(qiáng)或MMP-2、MMP-9/TIMP-2 比例失調(diào)是導(dǎo)致心室重構(gòu)和后期心功能惡化的重要因素［12］。該研究也為臨床防治心肌梗死的心室重構(gòu)提供了依據(jù)。

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