羅 宏，蘇吉兒，韓 松，李俊發(fā)

(首都醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)生物學(xué)系北京腦重大疾病研究院，北京100069)

國內(nèi)外研究數(shù)據(jù)顯示，血管相關(guān)性疾病位于國民死亡原因之首，其中腦卒中作為一種高致死、高致殘性疾病，給各國家庭和社會帶來了巨大的經(jīng)濟(jì)損失和精神負(fù)擔(dān)［1－2］。然而，目前臨床對腦卒中的治療尚缺乏有效的治療措施［3－4］。缺血/低氧預(yù)適應(yīng)(I/HPC)可提高組織器官對繼發(fā)嚴(yán)重缺血/低氧損傷的耐受，對這一內(nèi)源保護(hù)機(jī)制的研究，可為腦卒中臨床治療打開新視野［5］。近年研究表明，HPC 形成的眾多可能機(jī)制均涉及蛋白激酶C (PKC)的參與，且本實(shí)驗(yàn)室前期研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典型PKC Ⅱ(cPKCⅡ)、γ (cPKCγ)和新奇型PKCε(nPKCε)的膜轉(zhuǎn)位(激活)水平增高參與了小鼠腦HPC 形成的同時，cPKCγ 及其相互作用蛋白在HPC 保護(hù)缺血腦組織中發(fā)揮著重要作用［6－8］。據(jù)此，本實(shí)驗(yàn)擬利用小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞(N2a)的單純低氧和氧糖剝奪(OGD)模型，來模擬腦HPC 和缺血損傷，從離體水平上進(jìn)一步證實(shí)cPKCγ 在HPC 對抗N2a 細(xì)胞OGD 損傷中作用并探討其可能的細(xì)胞分子機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

兔源性LC3(Ⅰ、Ⅱ)抗體、鼠源性β-actin 抗體、蛋白酶抑制劑(亮肽酶素、抑肽酶、胃酶抑素A 及糜蛋白酶抑制素)、磷酸酶抑制劑(KF、岡田酸、焦磷酸鈉、原礬酸鈉)、脂氧膽酸鈉、DTT、NP-40、EDTA、EGTA、MTT、DMSO 和cPKCγ 抑制劑Go6983(Sigma-Aldrich 公司);辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔/鼠二抗(中山金橋生物技術(shù)有限公司);ECL 發(fā)光試劑盒(威格拉斯生物技術(shù)有限公司);BCA 蛋白定量試劑盒(Pierce 公司);凋亡試劑盒、CytoTox 96? 非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒(Promega 公司);Bio-MaxMR X-線膠片(Kodak 公司)。

1.2 N2a 細(xì)胞HPC 和OGD 模型制備

小鼠N2a 成神經(jīng)瘤細(xì)胞(北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部王韻教授實(shí)驗(yàn)室惠贈)，常規(guī)培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM(含高葡萄糖)(Gibco 公司)完全培養(yǎng)基中，并置入37 ℃、含21% O25% CO274% N2常氧混合氣體、飽和濕度培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，24 h換液，2 ～3 d傳代。

細(xì)胞HPC 模型:將N2a 細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM(含高葡萄糖)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、1% O25% CO294% N2低氧氣體、飽和濕度下培養(yǎng)。為確定HPC 發(fā)揮保護(hù)作用的最適低氧時間，通過預(yù)實(shí)驗(yàn)10、15、20 和25 min 4 個低氧暴露時間點(diǎn)，最后確定HPC 20 min為最適條件。

細(xì)胞OGD 模型:細(xì)胞培養(yǎng)于無血清的DMEM(無葡萄糖)培養(yǎng)基中，置于37 ℃、1% O25% CO294% N2低氧混合氣體、飽和濕度，根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要，培養(yǎng)2、3 或4 h，然后復(fù)糖復(fù)氧24 h。

cPKCγ 抑制劑Go6983 在細(xì)胞進(jìn)行HPC 前即刻加入，并在細(xì)胞培養(yǎng)基中保持終濃度為6 nmol/L。在觀察HPC 對OGD 細(xì)胞的保護(hù)作用實(shí)驗(yàn)中，N2a細(xì)胞先經(jīng)過HPC(20 min)預(yù)處理后復(fù)氧6 h，再進(jìn)行OGD 3 h處理。

1.3 MTT 比色法

將細(xì)胞接種于96 孔板，經(jīng)不同處理后加入3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴鹽(MTT)(Applichem 公司)并避光37 ℃放置4 h，MTT 可被線粒體內(nèi)脫氫酶還原生成結(jié)晶狀深紫色產(chǎn)物甲臜(formazan)，用DMSO 將其完全溶解后，通過酶標(biāo)儀測定490 nm波長的吸光度(A490)，來計算細(xì)胞生存率。

1.4 乳酸脫氫酶(LDH)漏出率

在96 孔板接種細(xì)胞，按照CytoTox 96? 非放射性細(xì)胞毒性檢測試劑盒規(guī)定步驟(Promega 公司)，定量測量(A490)細(xì)胞LDH 漏出率，來確定細(xì)胞壞死水平。

1.5 原位末端標(biāo)記(TUNEL)染色

細(xì)胞爬片、經(jīng)各組不同處理后，首先按Promega原位末端標(biāo)記(TUNEL)試劑盒步驟染凋亡細(xì)胞，然后用Hochest 33258 復(fù)染細(xì)胞核、封片、熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡情況。

1.6 蛋白印跡(Western blot)檢測

蛋白樣品制備、SDS-PAGE 和Western blot 參照文獻(xiàn)［6，8］。提取全細(xì)胞蛋白、BCA 法定量，－80 ℃保存?zhèn)溆?。每組樣品取50 μg蛋白進(jìn)行電泳(10% SDS-PAGE，4 ℃，20 ～30 mA)和轉(zhuǎn)膜(NC膜，400 mA，3 h)。先后用兔源性抗LC3(Ⅰ、Ⅱ，1∶1 000)和鼠源性β-actin(1∶1 000)一抗，辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔/鼠二抗(1∶4 000)進(jìn)行免疫雜交;然后用ECL 發(fā)光，X-線膠片曝光、顯影、定影。所得結(jié)果用Gel Doc 凝膠成像系統(tǒng)掃描后，對目的蛋白進(jìn)行定量分析。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

TUNEL 染色結(jié)果用Image Pro Plus 6.0 圖像軟件、Western blot 結(jié)果用Quantity One 軟件進(jìn)行定量分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行單因素方差分析(One way ANOVA)，組間比較采用Bonfferoni 檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞損傷的影響

將N2a 細(xì)胞進(jìn)行2 或4 h氧糖剝奪(OGD)，然后復(fù)糖復(fù)氧24 h。MTT 結(jié)果表明(圖1A)，OGD 2和4 h可使N2a 細(xì)胞的生存率分別降至(79.0 ±2.1)%和(36.9 ±2.0)%;LDH 漏出率結(jié)果顯示(圖1B)，OGD 2 和4 h組的細(xì)胞死亡率明顯增高(P＜0.05，n=6)。為了便于觀察cPKCγ 抑制劑Go6983和低氧預(yù)適應(yīng)(HPC)對OGD 致N2a 細(xì)胞凋亡、自噬和壞死的影響，如下實(shí)驗(yàn)均采用OGD 3 h、復(fù)糖復(fù)氧24 h作為模擬細(xì)胞缺血損傷的刺激。

圖2 細(xì)胞生存率結(jié)果表明，HPC(20 min)可明顯改善OGD 3 h對N2a 細(xì)胞的損傷作用(P＜0.05，每組n =16)，而cPKCγ 抑制劑Go6983(6 nmol/L)則明顯解除HPC 對OGD 細(xì)胞的保護(hù)作用(P＜0.05，每組n=16)。

2.2 cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞凋亡的影響

圖3 細(xì)胞TUNEL 染色結(jié)果示，OGD 3 h可明顯增加N2a 細(xì)胞的凋亡數(shù)目(P＜0.05，n=6)，但單純HPC(20 min)和cPKCγ 抑制劑Go6983 +HPC 均不能明顯地影響OGD 3 h 的細(xì)胞凋亡水平。提示cPKCγ 激活、HPC 對OGD 3 h細(xì)胞的保護(hù)作用均與細(xì)胞凋亡無關(guān)。

圖2 cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞損傷的影響Fig 2 Effects of cPKCγ and HPC on OGD-induced injury of N2a cells(±s，%，n=16)

2.3 cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞自噬的影響

利用Western blot 檢測LC3 Ⅱ與LC3 I 的比例(LC3 Ⅱ/Ⅰ)，來反映N2a 細(xì)胞的自噬水平。圖4可見，與常氧對照組(control)相比，OGD 3 h可明顯提高N2a 細(xì)胞的自噬水平(P＜0.01，n =6);與OGD 3 h組相比，抑制cPKCγ 激活(Go6983)和HPC+Go6983 均可明顯降低OGD 3 h細(xì)胞的自噬水平(P＜0.05，n =6)，而單純HPC(20 min)雖使OGD 3 h細(xì)胞的自噬水平有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義。提示cPKCγ 激活參與了OGD 3 h致N2a 細(xì)胞的自噬改變，而HPC 對OGD 3 h細(xì)胞的保護(hù)作用可能與自噬變化無關(guān)，但為什么HPC +Go6983 降低OGD 3 h細(xì)胞的自噬水平要比單純cPKCγ 抑制的作用更顯著，尚有待于進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)分析。

圖3 cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞凋亡的影響Fig 3 Effects of cPKCγ and HPC on OGD-induced cell apoptosis of N2a cells(±s，n=6)

圖4 cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞自噬的影響Fig 4 Effects of cPKCγ and HPC on OGD-induced cell autophagy of N2a cells(±s，n=6)

2.4 cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞壞死的影響

應(yīng)用乳酸脫氫酶(LDH)漏出率，來檢測N2a 細(xì)胞的壞死水平。圖5 結(jié)果表明，HPC(20 min)明顯改善OGD 3 h致N2a 細(xì)胞壞死的程度(P＜0.05，n=16)，而cPKCγ 抑制劑Go6983 則解除了HPC 的這種保護(hù)作用(P＜0.05，n = 16)。提示HPC 對OGD 3 h細(xì)胞的保護(hù)作用主要是通過cPKCγ 激活，來減輕N2a 細(xì)胞的壞死水平。

3 討論

缺血/低氧預(yù)適應(yīng)(I/HPC)是指組織器官接受亞致死性缺血/低氧預(yù)處理后，可對繼發(fā)發(fā)嚴(yán)重缺血/低氧性損傷產(chǎn)生耐受［5－6］。利用這一內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，人們在在體低氧/缺血損傷、離體海馬神經(jīng)元損傷和HPC 預(yù)處理干細(xì)胞移植等模型上均證實(shí)了HPC 對繼發(fā)神經(jīng)損傷有明顯的保護(hù)作用［9－11］。本實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用整體小鼠HPC 和大腦中動脈阻塞(MCAO)致腦缺血性卒中模型，也發(fā)現(xiàn)HPC 可顯著降低缺血腦組織的梗死體積、水腫率、梗死周圍區(qū)細(xì)胞丟失和細(xì)胞凋亡數(shù)目，改善缺血性卒中小鼠的神經(jīng)行為學(xué)評分，同時證實(shí)這些改變與cPKCγ 激活有關(guān)［8］。在此基礎(chǔ)上，本實(shí)驗(yàn)在離體細(xì)胞水平上進(jìn)一步證實(shí)了cPKCγ 在HPC 改善N2a 細(xì)胞OGD 損傷中具有重要作用。

圖5 cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞壞死的影響Fig 5 Effects of cPKCγ and HPC on OGD-induced cell necrosis of N2a cells(±s，%，n=16)

本實(shí)驗(yàn)參考以往文獻(xiàn)報道［9，11－12］，根據(jù)不同OGD 時間對N2a 小鼠成神經(jīng)瘤細(xì)胞生存率的影響程度，以及不同HPC 時間對OGD 細(xì)胞的保護(hù)作用，建立了OGD(OGD 3 h后復(fù)糖復(fù)氧24 h)和HPC(單純低氧暴露20 min、復(fù)氧6 h)的N2a 模型，來分別模擬在體腦缺血/低氧性損傷和低氧預(yù)適應(yīng)刺激。離體OGD 和HPC 細(xì)胞模型的成功建立，為深入研究腦缺血/低氧性損傷和適應(yīng)機(jī)制打下了良好基礎(chǔ)。

缺血/低氧性損傷途徑主要包括壞死、凋亡和自噬等［12－14］，那么cPKCγ 是通過何種損傷途徑參與了HPC 對OGD 細(xì)胞的保護(hù)作用。本實(shí)驗(yàn)通過觀察cPKCγ 和HPC 對OGD 致N2a 細(xì)胞凋亡、自噬和壞死的影響發(fā)現(xiàn)，OGD 可引起N2a 細(xì)胞發(fā)生顯著的凋亡、自噬和壞死改變，而cPKCγ 則主要是通過降低細(xì)胞壞死來發(fā)揮HPC 對OGD 細(xì)胞的保護(hù)作用，與本實(shí)驗(yàn)室在整體MCAO 致腦缺血性卒中模型小鼠上觀察到的部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果存在差異，即cPKCγ 激活介導(dǎo)了HPC 緩解腦梗死周圍區(qū)細(xì)胞凋亡的作用［8］。其原因可能與本實(shí)驗(yàn)所用N2a 細(xì)胞為神經(jīng)瘤細(xì)胞有關(guān)，即腫瘤細(xì)胞凋亡途徑可能與正常細(xì)胞存在差異［15］。因此，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果還有待于在其他細(xì)胞系和原代培養(yǎng)神經(jīng)元上證實(shí)和檢驗(yàn)。

總之，本實(shí)驗(yàn)在離體細(xì)胞水平上進(jìn)一步證實(shí)了cPKCγ 在HPC 改善N2a 細(xì)胞OGD 損傷中的重要作用，且這種作用主要是通過減輕OGD 細(xì)胞的壞死水平來實(shí)現(xiàn)N2a 細(xì)胞對OGD 損傷的耐受。但關(guān)于cPKCγ 究竟是通過介導(dǎo)何種信號傳導(dǎo)通路來參與HPC 的神經(jīng)保護(hù)作用，還有待于進(jìn)一步研究。

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