趙慧慧，呂文良

中國中醫(yī)科學院廣安門醫(yī)院感染疾病科，北京 100053

各種原因引起的肝細胞變性、壞死及炎癥，接著在壞死區(qū)出現(xiàn)細胞外基質(zhì)(ECM)的沉積，初期增生的纖維組織尚未形成假小葉，稱為肝纖維化(HF)，為可復性病變。目前公認的HF形成機制是從肝星狀細胞(HSC)的瀑布樣激活效應開始的?！叭郊せ钅Ｊ健庇?995年由德國Gressner［1］提出，第一步是前期炎性階段，第二步是炎性階段，第三步是炎癥后階段，在炎癥后階段，即使去除原來的肝損傷因素，也足以持續(xù)HF形成過程，因此是重要的、可能永存的階段。在HF的形成過程中，起著重要作用的是細胞因子，他們相互作用，共同構(gòu)成網(wǎng)絡狀調(diào)控機制。本文就TGF-β1的信號通路及其信號通路間的對話(crosstalk)進行綜述。

1 TGF-β1 與肝纖維化

轉(zhuǎn)化生長因子β超家族是一類具有旁分泌、自分泌作用的細胞因子，至少由30多種細胞因子組成，包括多種TGF-β(5種異體)、激活素、抑制素及骨形態(tài)發(fā)生蛋白等，來源廣泛，HSCs、Kupffer細胞、內(nèi)皮細胞、肝細胞等都可以分泌。其中TGF-β1是細胞和組織中最豐富的TGF-β成員，與HF發(fā)生、發(fā)展密切相關，除非特指，在很多研究中采用的TGF-β即為TGF-β1分子。有研究［2］顯示TGF-β1既可通過促進HSC合成Ⅰ型、Ⅲ型、Ⅳ型膠原及纖維連接蛋白、層黏連蛋白等增加ECM的合成;又可以通過抑制基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases，MMPs)合成、促進HSCs分泌組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase-1，TIMP-1)而減少ECM降解，還在HSCs活化過程中起著重要作用。鄭素軍等［3］研究表明TGF-β1對大鼠肝星狀細胞系HSC-T6顯示了促增殖作用，并能促進HF相關膠原的分泌，還可促進肝細胞、肝竇內(nèi)皮細胞、庫弗細胞、淋巴細胞等合成和分泌TGF-β1、EGF等促纖維化細胞因子，進一步激活HSCs，促進ECM分泌。在可調(diào)控TGF-β1表達的轉(zhuǎn)基因模型中發(fā)現(xiàn):過度表達TGF-β1一段時間后出現(xiàn)HSCs的活化及ECM沉積;一旦停止表達 TGF-β1，纖維化即可停止發(fā)展，甚至逆轉(zhuǎn)［4-5］。

2 TGF-β1 的信號通路

2.1 TGF-β1的信號通路的上游 TGF-β1在所有類型的細胞中均以無活性形式合成和分泌，其激活主要是受其前體潛在相關肽(latency-associated peptide，LAP)調(diào)節(jié)的［6］。TGF-β1的活化過程是可以逆轉(zhuǎn)的，若活化的TGF-β1重新結(jié)合為LAP，則可以使成熟的具有活性的TGF-β1轉(zhuǎn)變?yōu)闈摲问蕉セ钚裕?］。

2.2 TGF-β1的信號通路的下游 TGF-β1激活的信號通路主要有Smads通路和MAPK通路。

2.2.1 Smads通路:TGF-β1/Smads信號轉(zhuǎn)導分兩步:①TGF-β1與其受體結(jié)合及受體的活化;②Smads蛋白的激活。TGF-β1受體分為 TGF-β1Ⅰ型受體(TβRⅠ)和TGF-β1Ⅱ型受體(TβRⅡ)兩種。Smads蛋白家族是現(xiàn)階段被確認為細胞內(nèi)唯一的TβRⅠ激酶底物，是TGF-β1由膜受體到核內(nèi)目標基因信號轉(zhuǎn)導途徑的中心環(huán)節(jié)。根據(jù)Smads蛋白在TGF-β家族信號轉(zhuǎn)導中的作用，分為3類:(1)膜受體激活的Smad(R-smad)包括 Smad 1，2，3，5 和 8，R-Smad 的 MH2 域末端有 1個磷酸化序列Ser-Ser-x-Ser(SSXS)，其中Smad 2和3參與TGF-βs活化素信號途徑。(2)通用Smad(Cosmad)即Smad 4，其MH1域具有轉(zhuǎn)錄激活和核定位功能。(3)抑制性Smad(I-Smad)包括Smad 6、7，為TGF-β/Smad信號通路的抑制分子。I-Smad缺乏MH1區(qū)，C端沒有SSXS基序，所以不能被受體磷酸化，但可與活化的TβRⅠ牢固結(jié)合，阻止R-Smad的磷酸化，從而對該家族信號傳遞起負調(diào)控作用。Smad 7是TGF-β1信號轉(zhuǎn)導抑制分子，可與Smad 2或Smad 3競爭結(jié)合TGF-β1型受體或Smad 4，阻斷Smad 2或Smad 3被磷酸化及轉(zhuǎn)位至細胞核內(nèi)，抑制 TGF-β1信號轉(zhuǎn)導［8］。在整個Smads通路中，經(jīng)過多步的磷酸化反應，核質(zhì)穿梭運動及蛋白酶體的降解，最終由I-Smad終止反應。TGF-β1/Smads通路中各型Smad分子之間精密協(xié)調(diào)，共同完成生理及病理狀態(tài)下TGF-β的生物學效應。TGF-β1與其受體結(jié)合后激活Smad 2和Smad 3并磷酸化，其復合物與Smad 4形成異源三聚體復合物易位入核，與DNA結(jié)合，通過和轉(zhuǎn)錄因子的相互作用調(diào)節(jié)靶基因表達［9］。Tahashi等［10］在 HF 大鼠模型中發(fā)現(xiàn)，急性肝損傷時，TGF-β可快速誘導Smad 7的表達，使HSC內(nèi)TGF-β/Smad信號轉(zhuǎn)導通路呈平衡狀態(tài)，不致大量膠原蛋白生成。然而在HSC轉(zhuǎn)化為MFB后，R-smad持續(xù)磷酸化，Smad 7表達下調(diào)，最終引起ECM大量堆積，這可能是促發(fā)HF的原因之一。有研究［11］表明，當Smad 7含量高于Smad 3兩倍時，可抑制TGFβ1受體介導的Smad 3磷酸化，進而使 TGF-β1信號傳導中斷。另外，TGF-β1/Smads信號通路也是血管緊張素Ⅱ、醛固酮等所致器官纖維化的共同通路。

2.2.2 MAPK通路:絲裂原活化蛋白激酶(mitogen activated protein kinase，MAPK)通路是激活后向核內(nèi)轉(zhuǎn)移并作用于核內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子的一個蛋白激酶家族，是真核細胞介導細胞外信號到細胞內(nèi)反應的重要信號傳導系統(tǒng)之一，其通過連接細胞表面受體和細胞內(nèi)關鍵調(diào)控因子參與基因的表達。它以保守的三級激酶級聯(lián)形式［12］激活，即 MAPKKK→MAPKK→MAPK激活后，參與細胞的多種生理病理過程。MAPK信號通路家族主要包括細胞外信號調(diào)節(jié)蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinases，ERK)、P38、c-Jun 氨基末端激酶(amino-terminal kinase，NK)/應激活化蛋白激酶(stress-activated protein kinase，APK)和大絲裂原激活蛋白激酶 ERK5/BMK1(big MAP kinase 1)。而P38MAPK作為MAPK家族的重要信號通路，在細胞炎癥、增殖、應激、凋亡、細胞周期和生長等多種生理和病理過程中起著重要作用［13］。研究顯示［14］，炎癥刺激可激活P38 MAPK，而P38 MAPK也可以通過調(diào)節(jié)TNF、IL-1和IL-6等致炎因子以及IL-12等抗炎因子的生成來影響生物體內(nèi)致炎與抗炎因素的平衡，從而決定炎癥反應的進程。有研究證實［15-16］，P38 MAPK在多種與缺血缺氧應激有關的血管損傷性疾病中起重要作用，能引起血管內(nèi)皮生長因子分泌增強、肝內(nèi)血管增生，從而導致肝竇毛細血管化。α-SMA是活化HSC的特征標志之一，研究發(fā)現(xiàn)［17］，用阻斷劑 SB203580阻斷P38 MAPK可以降低靜息HSC的α-SMA蛋白表達，并可調(diào)節(jié)其細胞周期，改變 HF的進程。P38 MAPK通路的重要下游因子是ATF-2，它可作用于靶基因引起轉(zhuǎn)錄響應，Shuman等［18］研究報道ATF可在肝組織中表達，并且其特定堿基被P38 MAPK磷酸化后表現(xiàn)出明顯增加的DNA結(jié)合和轉(zhuǎn)錄活性。

3 TGF-β1信號通路間的對話

TGF-β1是一種高活性、多功能生物信號分子，而這種多功能性是通過各種信號通路間的對話實現(xiàn)的。Sano等［19］報道 ATF-2 是 TGF-β 介導的 MAPK 和Smads兩條信號傳導途徑中的共同靶位。有研究發(fā)現(xiàn)［20］，Smad通路及MAPK通路分別獨立并可協(xié)同的增加HSCⅣ型膠原的基因表達。在HSC轉(zhuǎn)分化的過程中，TGF-β可以通過激活MAPK信號轉(zhuǎn)導通路，并進一步導致Smad 3與Smad 2的連接部位磷酸化，促進Smad 3和Smad 4復合體的形成及轉(zhuǎn)入核內(nèi)而發(fā)揮作用［21］。Bakin 等［22］發(fā)現(xiàn) PI3-K 的抑制劑 LY294002可以阻止 TGF-β1誘導的 Smad 2磷酸化反應、降低Smad 3的活性及終止TGF-β1刺激的Ⅰ膠原基因的轉(zhuǎn)錄，表明Smad蛋白也可能是PI3-K通路的一個靶點，Smads和PI3-K在調(diào)節(jié)TGF-β1介導的Ⅰ型膠原的表達中存在對話。

對于Smad與ERK信號通路間的對話仍存在爭議，不同的細胞類型，ERK與Smad信號通路的相互作用存在差異。在平滑肌細胞中，ERK磷酸化可以促進Smad蛋白磷酸化;而在上皮細胞中，ERK磷酸化反而抑制 Smad 蛋白磷酸化［23］。唐靜等［24］在 TGF-β1誘導的 HSC中，加入 PD98059阻斷 ERK通路后，活化的HSC數(shù)量明顯減少，且細胞內(nèi)Smad 2、Smad 3蛋白磷酸化水平下降，提示Smad 2/3是ERK激酶的下游信號分子之一。有實驗研究［11］在加入 PD98059處理后，Smad 7 mRNA及Smad 7蛋白水平均明顯下降，表明Smad 7不但在TGF-β1/Smad通路中為負性調(diào)節(jié)元件，而且ERK通路的活化也可進一步促進 TGF-β1誘導的Smad 7高表達。趙輝平等［25］實驗發(fā)現(xiàn)HF大鼠肝組織α-SMA和ERK磷酸化(p-ERK)蛋白水平顯著上調(diào)，Ras p21表達水平上調(diào)，ERK蛋白表達水平無大變化，TβRⅠ可經(jīng)Ras/ERK通路促進膠原合成，印證了ERK依賴的R-smad接頭域的磷酸化作用增強了Ⅰ型膠原合成，提示ERK和Smads信號之間在膠原產(chǎn)生上存在著協(xié)同作用。在研究ERK和Smads信號之間的對話時，需要進一步了解ERK分別對于R-Smad和I-Smad的作用強度，以了解兩者在HF共同作用時的機理。

此外，TGF-β1與其他細胞因子的信號通路也存在對話。有研究［26］表明，TGF-β1可劑量相關性地增加HSC表達 PDGF-β受體，從而明顯增強 PDGF促進HSC增殖的作用。對于TGF-β1與上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-to-mesenchyme transition，EMT)之間的對話存在爭議，Zeisberg 等［27］發(fā)現(xiàn) TGF-β1 可以促進 EMT，促進肝纖維化。但Scholten等［28］對此提出異議，他質(zhì)疑Zeisberg等試驗檢測物質(zhì)及試驗檢測方法欠準確，經(jīng)改進后，他的轉(zhuǎn)基因鼠試驗發(fā)現(xiàn)不論用TGF-β1還是CCl4誘導HF，都不能證明肝細胞發(fā)生了EMT。然而國內(nèi)李婷芬等［29］證明了肝細胞 HL7702經(jīng)過 TGF-β1誘導后確實發(fā)生了 EMT，肝細胞失去了上皮化特性和功能，具有間質(zhì)化細胞的特性和分泌膠原的功能。Kaimori等［30］發(fā)現(xiàn)用 Smad 4-siRNA干擾小鼠肝細胞后，抑制了 TGF-β1誘導EMT和Ⅰ型膠原的表達，且依然保留上皮化表型和功能，說明TGF-β1/Smads信號通路是EMT發(fā)生的重要信號通路。那么進行Smad 4-siRNA干擾之后，肝細胞是否會發(fā)生 EMT仍有待于進一步研究。

由于TGF-β1具有多功能性，完全阻斷可能會產(chǎn)生嚴重的副作用［31］。為減少其可能產(chǎn)生的不良反應，選擇恰當?shù)闹委煱袠顺闪吮匾鉀Q的問題。大量研究表明，Smad 3是介導 TGF-β1誘導HF的關鍵分子。鄭素軍等［3］發(fā)現(xiàn)將Smad 3 siRNA放入慢病毒感染大鼠肝星狀細胞系 HSC-T6細胞，Smad 3 mRNA表達受到明顯抑制，間接抑制了TGF-β1對HSC-T6的活化，顯示了抗HF作用。Schnabl等［32］研究發(fā)現(xiàn)在Smad 3基因敲除鼠HF時較野生型大鼠HF時I型膠原表達下降，但α-SMA無明顯變化，表明活化的HSC要產(chǎn)生膠原合成的最適表達必須有Smad 3參與，而HSC活化與Smad 3無關，但增殖與Smad 3有關。

TGF-β1的信號通路及自身信號通路之間的對話與其他細胞因子之間的對話仍存在未知問題，隨著各種細胞因子信號通路的深入研究，我們將會對其相互作用機制有進一步的了解，為選擇合適的HF治療靶點提供依據(jù)。

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