鐘昔陽 張淑芬 徐玉紅 吳 欣

(合肥工業(yè)大學(xué)生物與食品工程學(xué)院，合肥 230009)

生物活性肽具有參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)[1]、抗氧化[2]、降血壓[3]及抗菌性[4]等多種生物學(xué)功能，在食品、醫(yī)藥、飼料工業(yè)得到廣泛的開發(fā)和應(yīng)用，以小麥面筋蛋白、花生蛋白、大豆蛋白等植物性蛋白為原料酶解制備生物活性肽成為當(dāng)前糧油深加工領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)[5－6]。與花生蛋白、大豆蛋白性質(zhì)不同，小麥面筋蛋白含有大量的非極性氨基酸殘基(如脯氨酸、亮氨酸)和極性的不可電離的谷氨酰胺殘基，側(cè)鏈帶電荷氨基酸含量低，因此在水溶液體系中溶解性極低[7－8]，在酶解過程中，酶分子與蛋白質(zhì)底物無法充分接觸，造成水解度低，酶解進(jìn)程慢，酶解效率低[9]。因此，尋找一種高效酶解小麥面筋蛋白的新方法成為當(dāng)前國內(nèi)外學(xué)者研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)。

采用物理、化學(xué)方法預(yù)處理蛋白原料再進(jìn)行酶解是提高蛋白酶解效率的一種重要手段。在小麥面筋蛋白的酶解加工中，趙海峰等[10]采用擠壓預(yù)處理后，利用復(fù)合蛋白酶酶解小麥面筋蛋白，水解度明顯提高。Liao等[11]分別采用 0.082 mol/L乙酸、0.137 mol/L鹽酸在室溫下與小麥面筋蛋白反應(yīng)2 h后用胰蛋白酶水解，水解度和氮溶解指數(shù)均有所提高。Kanerva等[12]采用脫酰胺處理后再酶解小麥面筋蛋白，溶解性、表面活性均有所增加，且酶解產(chǎn)物降低了抗體反應(yīng)。Drago等[13]對小麥面筋蛋白進(jìn)行適當(dāng)熱處理后再酶解，其溶解度和水解度都顯著增加。Popineau等[14]、Berot等[15]研究發(fā)現(xiàn)在酶解小麥面筋蛋白前加入一定量的半胱氨酸，可有效提高其酶解效率。

十二烷基硫酸鈉(SDS)是一類含有親水親油基的陰離子表面活性劑，能降低溶質(zhì)和溶劑間的表面張力，廣泛用于牙膏、香波、化妝品、制藥、化工等行業(yè)。SDS的安全性較高，在我國它作為食品加工助劑、食品用消毒劑用于蛋糕、飲料、食用油生產(chǎn)以及餐具、食品加工設(shè)備的消毒[16]。此外，在面筋蛋白的增溶[17]、可食性膜的生產(chǎn)[18]中 SDS也得到了研究應(yīng)用。在中藥材加工行業(yè)，已有學(xué)者開展了利用SDS提取薯蕷皂苷[19]、姜黃素[20]、黃酮類[21]等中藥材活性成分的研究。筆者近年來也開展了SDS的相關(guān)應(yīng)用研究，在前期試驗(yàn)研究中發(fā)現(xiàn)，加入SDS預(yù)處理小麥面筋蛋白后再酶解可以較好提高其酶解效率。本研究在此基礎(chǔ)上，通過單因素、正交試驗(yàn)進(jìn)一步研究堿性蛋白酶酶解體系下各種工藝參數(shù)對SDS預(yù)處理小麥面筋蛋白的酶解效率影響，優(yōu)化確定最佳工藝條件，以期尋找一種提高小麥面筋蛋白酶解效率制備生物活性肽的加工新方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

小麥面筋蛋白(粗蛋白79.63%，水分6.17%):山東江口生物科技有限公司；堿性蛋白酶(BR，200 000 U/g):北京奧博星生物技術(shù)有限責(zé)任公司；SDS(食品級):鄭州金利來生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BR):上海源聚生物科技有限公司；三氯乙酸(AR):天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所；甲醛溶液(AR):無錫市展望化工試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

HH－2數(shù)顯恒溫水浴鍋:江蘇省金壇市榮華儀器有限公司；SC－3614低速離心機(jī):安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；722E型可見分光光度計(jì):上海光譜儀器有限公司；UDK 152型自動凱氏定氮儀:意大利VELP公司；BL－220H電子天平:上海皖衡電子儀器有限公司；FJ－200高速分散均質(zhì)機(jī):上海標(biāo)本模型廠；PHS－3B精密pH計(jì):上海虹益儀器儀表有限公司。

1.3 小麥面筋蛋白酶解工藝流程

小麥面筋蛋白溶于一定濃度的SDS水溶液→均質(zhì)(8 000 r/min，20 s)→調(diào)節(jié) pH→加入一定量的堿性蛋白酶→50℃恒溫酶解一定時(shí)間→滅酶(95℃，15 min)→離心(2 862×g，15 min)→上清液(即為酶解液)→測DH和多肽得率

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 水解度的測定

水解度(DH)是衡量蛋白質(zhì)水解程度的指標(biāo)，一般指蛋白質(zhì)分子中斷裂的肽鍵占蛋白質(zhì)分子中總肽鍵的比例。由于每裂解一個(gè)肽鍵同時(shí)新生成一個(gè)氨基和一個(gè)羧基，因此，定量測出游離氨基氮含量就可以計(jì)算出斷裂的肽鍵。

取5 mL混合水解液，加入60 mL沸騰后又冷卻的蒸餾水，調(diào)節(jié)pH至8.2，加入10 mL中性甲醛，反應(yīng)片刻，用0.1 mol/L標(biāo)準(zhǔn)NaOH滴定到pH＝9.2，記錄所耗NaOH的量，同時(shí)作空白試驗(yàn)[22]。

游離氨基酸含量(mg/mL)＝[N×(V1－V2)×14.008]÷5

DH＝[游離氨基氮(mg/mL)×上清液體積(mL)×10－3]/[樣品質(zhì)量(g)×總氮含量)]×100%

式中:N為 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度/mol/L；V1為樣品消耗 NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；V2為空白消耗NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液體積/mL；14.008/1 mL濃度為1.000 mol/L NaOH標(biāo)準(zhǔn)溶液相當(dāng)于氮的質(zhì)量/mg。

1.4.2 多肽得率的測定

1.4.2.1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程的建立

準(zhǔn)確稱取1.000 0 g牛血清白蛋白溶于一定量的蒸餾水中，在4℃冰箱中放置使牛血清白蛋白完全溶解，取出，放至室溫，定容至 100 mL，配制成10 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，再稀釋成2～10 mg/mL一系列不同濃度的蛋白溶液，取稀釋液1 mL，加入4 mL雙縮脲試劑。充分搖勻后，在室溫(20～25℃)下放置30 min，于540 nm處進(jìn)行比色測定，每個(gè)樣品測3次取平均值，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標(biāo)，以吸光度值為縱坐標(biāo)，得標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為y＝0.055 8x＋0.006 4，R2＝0.998 2，式中:x為牛血清白蛋白濃度(mg/mL)，y為在540 nm處的吸光值。

1.4.2.2 酶解液多肽含量的測定

三氯乙酸沉淀法:參照魯偉等[23]測多肽的方法，并作一定修改:取2.0 mL酶解液，加入2.0 mL 10%(W/V)三氯乙酸(TCA)水溶液，震蕩混合，靜置10 min后，在離心力為2 862×g下離心15 min，取1 mL上清液，加入4 mL雙縮脲試劑，充分搖勻后，在室溫下靜置 30 min，以5%TCA溶液作空白，于540 nm下測其吸光度，根據(jù)上述標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算多肽質(zhì)量。

式中:m1為上清液中多肽質(zhì)量/g；m為樣品中總蛋白質(zhì)量/g。

1.5 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

堿性蛋白酶是當(dāng)前酶解小麥面筋蛋白制備多肽效果較好的一種蛋白酶，在各類研究中應(yīng)用較多，結(jié)合資料文獻(xiàn)[24]，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)中固定酶解溫度為其最適溫度50℃，以DH和多肽得率為指標(biāo)，通過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，研究酶解時(shí)間、SDS添加量、底物濃度、酶濃度、pH對小麥面筋蛋白酶解的影響，確定酶解小麥面筋蛋白制備多肽的最佳工藝條件。其中，在酶解pH＝10的條件下，L9(34)正交試驗(yàn)的因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 正交試驗(yàn)因素水平表

1.6 數(shù)據(jù)處理

每個(gè)試驗(yàn)重復(fù)3次，結(jié)果采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差的形式表示，試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Excel 2003和正交設(shè)計(jì)助手V3.1軟件進(jìn)行處理。

2 結(jié)果與分析

2.1 小麥面筋蛋白酶解單因素試驗(yàn)

2.1.1 酶解時(shí)間對酶解效果的影響

SDS添加量4 mg/mL，底物濃度10 g/100 mL，酶濃度7 mg/mL，pH 9，50℃恒溫酶解，時(shí)間分別為1、2、3、4、5、6 h，酶解時(shí)間對水解度和多肽得率的影響如圖1。

圖1 酶解時(shí)間對水解度和多肽得率的影響

由圖1可知，在一定時(shí)間內(nèi)，隨著時(shí)間的延長，小麥面筋蛋白逐漸地被水解，DH和多肽得率都顯著增加(P＜0.01)，水解4 h時(shí)，DH和多肽得率均達(dá)到最大值，水解時(shí)間超過4 h時(shí)，DH幾乎不增加，多肽得率稍有下降，原因可能是4 h以前，堿性蛋白酶把小麥面筋蛋白大分子水解成小分子的肽段，DH和多肽得率都增加，水解時(shí)間大于4 h時(shí)，分子質(zhì)量較小的肽段被進(jìn)一步水解成氨基酸，使多肽的檢測結(jié)果偏低，因此，酶解時(shí)間為4 h比較合適。

2.1.2 SDS添加量對酶解效果的影響

底物濃度 10 g/100 mL，酶濃度 7 mg/mL，pH 9，50℃恒溫酶解4 h，研究SDS不同添加量對酶解效果的影響，結(jié)果如圖2。

圖2 SDS添加量對水解度和多肽得率的影響

SDS添加量不同時(shí)，DH和多肽得率大小不同。SDS添加量較低時(shí)，DH和多肽得率增幅不大，隨著SDS濃度的增加，DH和多肽得率先增加后降低且趨勢基本一致。當(dāng)SDS添加量為4 mg/mL時(shí)，DH和多肽得率都達(dá)到最大值。這可能是因?yàn)椋琒DS是一種離子型乳化劑，主要通過離子鍵與高分子質(zhì)量谷蛋白相互作用釋放出更多的低分子質(zhì)量谷蛋白，通過分子中疏水長鏈與蛋白質(zhì)分子內(nèi)部的非極性基團(tuán)相互作用，使谷蛋白分子間作用力減弱，可溶性肽段增加[25]。它還能使分子內(nèi)和分子間氫鍵斷裂，這使得小麥面筋蛋白與堿性蛋白酶接觸面積增大，因此，DH和多肽得率都增加。SDS添加量增大時(shí)，可能使小麥面筋蛋白分子構(gòu)象發(fā)生進(jìn)一步轉(zhuǎn)變，不利于堿性蛋白酶定向靠近，DH和多肽得率下降，因此，SDS添加量為4 mg/mL。

2.1.3 底物濃度對酶解效果的影響

SDS添加量為4 mg/mL，酶濃度7 mg/mL，pH 9，50℃恒溫酶解4 h，底物濃度對DH和多肽得率的影響如圖3。

圖3 底物濃度對水解度和多肽得率的影響

由圖3知，其他條件不變時(shí)，隨著底物濃度的增加，DH和多肽得率先增加后減小，變化顯著(P＜0.01)，這是因?yàn)榈孜餄舛容^低時(shí)，酶相對充足，絕大部分蛋白質(zhì)參與反應(yīng)；隨著底物濃度的增加，溶液中易于流動的水減少，阻礙了蛋白酶和底物在溶液中的擴(kuò)散運(yùn)動，根據(jù)酶促反應(yīng)原理，高濃度的底物會對酶產(chǎn)生抑制作用，生成的多肽也可能會反饋抑制酶的水解反應(yīng)[26]。在蛋白水解反應(yīng)中，對同一種底物，酶活性也會發(fā)生不可逆抑制性[27]，所以DH和多肽得率相對降低。因此底物濃度為10 g/100 mL較合適。

2.1.4 酶濃度對酶解效果的影響

SDS添加量4 mg/mL，底物濃度10 g/100 mL，酶濃度分別為 3、5、7、9、11、13 mg/mL時(shí)，50℃酶解4 h，結(jié)果如圖4。

圖4 酶濃度對水解度和多肽得率的影響

由圖4可知，底物濃度一定時(shí)，隨著酶濃度的增加，DH和多肽得率顯著增加(P＜0.01)，且在9 mg/mL時(shí)多肽得率達(dá)到最大值；超過9 mg/mL時(shí)，DH增加緩慢，多肽得率反而下降。這是由于酶具有顯著的對映性和區(qū)域選擇性，在底物濃度遠(yuǎn)大于酶濃度時(shí)，隨著酶量的增加，更多的小麥面筋蛋白被酶解，產(chǎn)生較多的肽段，DH和多肽得率顯著增加；但在酶解過程中總會產(chǎn)生底物或產(chǎn)物抑制性，所以當(dāng)酶量繼續(xù)增加時(shí)，大量的小麥面筋蛋白分子被水解，產(chǎn)生較多相對分子質(zhì)量小的多肽物質(zhì)，抑制了酶解反應(yīng)的進(jìn)行[28－29]，DH增加緩慢，而多肽進(jìn)一步水解成氨基酸，多肽得率稍有下降，因此，選擇酶濃度為 9 mg/mL。

2.1.5 pH值對酶解效果的影響

SDS添加量為4 mg/mL，底物濃度10 g/100 mL，酶濃度9 mg/mL，酶解時(shí)間 4 h，pH值分別是 8、9、10、11、12時(shí)，結(jié)果如圖5。

圖5 酶解pH值對水解度和多肽得率的影響

由圖5可知，pH值不同，DH和多肽得率顯著不同(P＜0.01)。pH值在8～12范圍內(nèi)，隨著pH值的增加，DH和多肽得率先增加后減小，這是由于每一種酶都有一個(gè)最適pH，此時(shí)，酶活性最大，pH值過高或過低，都影響酶分子中弱酸堿基團(tuán)的解離，酶活性中心與底物的契合，酶活性中心催化基團(tuán)的催化效率[30]，從而使酶解效率降低。由試驗(yàn)結(jié)果可知，堿性蛋白酶作用于小麥面筋蛋白的最適pH為10。

2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果與分析

全面分析上述單因素試驗(yàn)結(jié)果，酶解時(shí)間、SDS添加量、底物濃度、酶濃度對DH和多肽得率的影響最為顯著，在固定pH＝10的條件下，根據(jù)正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，共進(jìn)行9組試驗(yàn)，試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見表2，方差分析見表3。

由表2可以看出，第8號試驗(yàn)組合條件A2B3C1D3的水解度和多肽得率最大，效果最好。由直觀分析及方差分析可知，各因素對DH影響的主次順序?yàn)锽DAC，最佳組合條件是A3B3C1D3，SDS添加量和酶濃度對DH影響顯著；對多肽得率影響的主次順序?yàn)锽ADC，最佳組合條件是A2B3C1D3，酶解時(shí)間、SDS添加量對多肽得率影響高度顯著，酶濃度影響顯著，底物濃度對兩指標(biāo)均不顯著。DH和多肽得率的最優(yōu)組合稍有差別，但酶解時(shí)間對DH不顯著，對多肽得率顯著，因此，酶解時(shí)間為2水平是最優(yōu)的選擇，則正交試驗(yàn)最優(yōu)組合條件為A2B3C1D3，與8號試驗(yàn)一致，即:酶解時(shí)間4 h，SDS添加量4 mg/mL，底物濃度8 g/100 mL，酶濃度 9 mg/mL，此時(shí)，DH為 12.36%，多肽得率為57.24%。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果及直觀分析

表3 正交試驗(yàn)方差分析

3 結(jié)論

論文通過對單因素試驗(yàn)進(jìn)行全面分析，酶解時(shí)間、SDS添加量、底物濃度、酶濃度4個(gè)因素對DH和多肽得率最顯著，在固定pH 10的條件下，對酶解時(shí)間、SDS添加量、底物濃度、酶濃度進(jìn)行L9(34)正交試驗(yàn)，最終確定酶解小麥面筋蛋白的最佳工藝條件為:酶解時(shí)間 4 h，SDS添加量 4 mg/mL，底物濃度8 g/100 mL，酶濃度 9 mg/mL，此時(shí)，DH為 12.36%，多肽得率為57.24%。

本試驗(yàn)利用SDS預(yù)處理小麥面筋蛋白后再用堿性蛋白酶酶解處理，顯著提高了小麥面筋蛋白的水解度和多肽得率，這為提高小麥面筋蛋白酶解效率提供了一個(gè)新方法。在后續(xù)研究中，將對酶解混合物進(jìn)一步分離純化制備不同分子質(zhì)量區(qū)間段的多肽產(chǎn)品，并對其安全性、生物活性開展系統(tǒng)研究，以期實(shí)現(xiàn)酶解面筋蛋白多肽產(chǎn)品在食品、飼料、醫(yī)藥、化工等工業(yè)的實(shí)際應(yīng)用。

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