袁清華，謝銳鴻，馬柱文，張振臣，李淑玲，李集勤，陳俊標(biāo)

廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所煙草研究室，廣州市天河區(qū)五山金穎西二街18號 510640

煙草青枯?。═obacco bacterial wilt ）發(fā)生時可嚴(yán)重影響煙葉產(chǎn)量，防治措施主要包括抗病育種、合理耕作、藥劑防治和生物防治[1-2]?？共∮N從品種特性入手對煙草進(jìn)行抗性改良，是一條經(jīng)濟(jì)、環(huán)保、有效的途徑?？共∮N過程中，育種材料的選擇決定育種工作的成敗。因此了解抗病材料的抗性機(jī)理可為育種材料的選擇提供理論依據(jù)。煙草青枯病抗性鑒定通常用抗病品種Dixie Bright101（DB101）作為抗病對照[3]。DB101來源于美國[4]，是較早選育的抗青枯病的煙草品種。但對其進(jìn)行抗性機(jī)理研究的報道較少見。

作為一種新的研究蛋白質(zhì)差異表達(dá)的技術(shù)，蛋白質(zhì)組學(xué)為研究作物抵抗病原微生物的機(jī)理提供了一條十分重要的途徑。這是由于無論是病原微生物對宿主的識別和入侵還是宿主對病原微生物的識別與抵抗，這兩個不同作用路徑中的各個環(huán)節(jié)，都有不同的蛋白質(zhì)發(fā)揮著不同的作用[5]。同時，在宿主抵抗病原微生物入侵時發(fā)生的各種生物學(xué)響應(yīng)機(jī)制也有蛋白質(zhì)的參與[6]。有些具有酶功能的蛋白質(zhì)還參與到抗病過程的各種生理生化過程并發(fā)揮十分重要的作用。蛋白質(zhì)是基因表達(dá)的結(jié)果，是病原入侵時表現(xiàn)抗性的直接作用物。通過蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，尋找抗病材料與病原菌相互作用時的差異表達(dá)蛋白，能夠從蛋白表達(dá)水平上了解作物的抗病機(jī)理，以及其中蛋白之間的相互作用。因此，蛋白質(zhì)組學(xué)可以在研究作物的抗病機(jī)制中發(fā)揮重要的作用。

宋浩等[7]進(jìn)行不同煙草青枯病抗性品種的蛋白質(zhì)組學(xué)比較研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)2個不同抗性品種間的蛋白質(zhì)組分不同，26 個蛋白質(zhì)在 2 個不同抗性品種中發(fā)生了差異變化，其中在DB101 表達(dá)量上升的有12個，在紅花大金元表達(dá)量上升的有14 個。本試驗應(yīng)用蛋白質(zhì)膠條鑒定技術(shù),對DB101在接種后應(yīng)對青枯病菌入侵時部分蛋白質(zhì)組分的變化過程進(jìn)行了探索。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

植物材料：DB101種子為本研究室保存資源。

病原菌材料：中等致病力的青枯菌(由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)劉瓊光老師提供)。

1.2 實驗方法

本試驗分別在田間盆栽和人工氣候箱兩個不同環(huán)境下進(jìn)行研究，對兩個不同環(huán)境下的總蛋白質(zhì)組分以SDS-PAGE指紋圖譜的方式考察其發(fā)病前后的總體變化趨勢。通過比較選擇田間盆栽樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)膠條鑒定。

1.2.1 田間盆栽試驗

2011年7月5日播種，9月2日移栽，移栽后一周施肥一次。旺長期接種。于2011年11月1日、2011年11月2日分別取樣，對應(yīng)編號為A、B系列樣品。選取3株長勢相近、發(fā)病情況一致的煙株，各摘取1片葉片合并裝入自封袋，磨樣時每個自封袋為一個重復(fù)。

1.2.2 人工氣候箱接種試驗

1.2.2.1 培養(yǎng)青枯菌

將凍存的青枯菌菌種劃線活化，挑取單菌落接種于100 m LNA液體培養(yǎng)基中，28℃，100 rpm搖床搖菌24 h，培養(yǎng)至菌液濃度約為3.9×108cfu/mL。

1.2.2.2 青枯病接種試驗

2011年10月12日播種，發(fā)芽后適時間苗，每盆保留一株。2011年12月16日接種。用剪刀插入栽培基質(zhì)使根損傷然后淋下1 mL青枯菌液，2個重復(fù)。2盆（株）注射清水，作為對照。2011年12月20日接種處理的煙株均發(fā)病，進(jìn)行拍照，并摘取從底部向上數(shù)第3片葉片作為樣品。將樣品裝入自封袋，-80攝氏度保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2. 3 SDS聚丙烯酰胺凝膠電泳

1.2.3.1 提取蛋白質(zhì)

以上樣品各稱取5 g，剪碎研磨成粉末提取蛋白質(zhì)，方法參照Wang等[8]。

1.2.3.2 蛋白質(zhì)定量

各取前面制備的蛋白粉末約30 mg，溶解于600 uL 1×上樣緩沖液（不含溴酚藍(lán)指示劑），振蕩，置于4℃冰箱溶解過夜。取出離心。取50 uL蛋白質(zhì)溶液、50 uL 1×上樣緩沖液分別定容到2 mL,以稀釋后的上樣緩沖液作為空白測各個樣品的260 nm和280 nm處吸光值。根據(jù)經(jīng)驗公式（趙亞華，2005）計算：蛋白質(zhì)濃度=1.45×A280 - 0.74×A260 (mg/mL)計算各個樣品的相對濃度。根據(jù)相對濃度調(diào)整上樣量，以達(dá)到各樣品總蛋白量一致。Maker加5 μL。

1.2.3.3 電泳

配制15%濃度的分離膠，5%的濃縮膠。用上樣緩沖液溶解蛋白質(zhì)樣品上樣。70V低電壓濃縮，110V電壓電泳。分離膠、濃縮膠、上樣緩沖液配方參照《蛋白質(zhì)與蛋白質(zhì)組實驗指南》（Richard J.Simpson 主編，何大澄主譯 2006）。上樣緩沖液以DTT（二硫蘇糖醇）代替巰基乙醇。

1.2.4 蛋白質(zhì)膠條鑒定

對樣品進(jìn)行蛋白液提取和凝膠電泳分離； 對膠條進(jìn)行識別、編號，并切膠；膠內(nèi)酶解，并洗脫，得到肽段混合物；通過LC-MS/MS質(zhì)譜分析，得到原始質(zhì)譜數(shù)據(jù)。通過實驗串聯(lián)質(zhì)譜數(shù)據(jù)，與數(shù)據(jù)庫模擬得到的理論質(zhì)譜數(shù)據(jù)進(jìn)行匹配，從而得到蛋白質(zhì)鑒定結(jié)果。基于蛋白鑒定結(jié)果，做GO，COG，Pathway等分析。蛋白質(zhì)鑒定的工具是蛋白質(zhì)搜索鑒定軟件Mascot，軟件版本：Mascot 2.3.02。鑒定選用數(shù)據(jù)庫：茄目Solanales txid4069 43571 sequences。搜索選用的酶為胰蛋白酶。選用的儀器：LTQ-Otbitrap-Velos。膠條鑒定由華大基因公司完成。

1.2.5 儀器設(shè)備

臺式離心機(jī)3SR+ :Thermo，光密度掃描儀GS-800 :Bio-Rad，Concentrator plus真空離心濃縮儀：Eppendorf，PowerPac Universal電泳儀電源：Bio-Rad，Mini-Protein Tetra System微型垂直電泳系統(tǒng)：Bio-Rad，紫外可見分光光度計DU 800 ：貝克曼庫爾特。

2 結(jié)果與分析

2.1 SDS電泳比較

SDS電泳結(jié)果（圖1）顯示，田間試驗結(jié)果與人工氣候箱試驗結(jié)果有一致的變化趨勢，即在抗病過程中，部分蛋白質(zhì)組分發(fā)生消解，在表達(dá)量上產(chǎn)生明顯的變化，尤其在分子量大小約為50～60 kD之間的變化最顯著。

圖1 DB101在田間與光照培養(yǎng)箱中抗青枯病過程蛋白質(zhì)組分的SDS-PAGE電泳比較

為進(jìn)一步明確兩種不同環(huán)境中植株發(fā)病前后發(fā)生顯著變化蛋白質(zhì)具體組分，本研究裁割FN2（未發(fā)病植株）、FI1（發(fā)病植株）SDS-PAGE泳道中分子量在50～60 kD之間發(fā)生顯著變化的條帶進(jìn)行蛋白質(zhì)膠條鑒定。

2.2 蛋白質(zhì)膠條鑒定結(jié)果

膠條鑒定結(jié)果顯示，兩個樣品的膠條分別鑒定出168和162種蛋白質(zhì)組分（表1）。99種組分在發(fā)病前后的植株均存在。69種組分僅在未發(fā)病植株中出現(xiàn)，63種組分僅在發(fā)病植株中出現(xiàn)。進(jìn)一步對這些已鑒定出的蛋白進(jìn)行生物信息學(xué)分析。比較兩樣品間的差異。

2.3 GO分析

圖2為兩樣品各自鑒定出的蛋白質(zhì)組分的GO分析結(jié)果。比較兩者間的差異發(fā)現(xiàn)，兩樣品在不同的生物學(xué)過程中表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量有所不同。各個生物過程中未發(fā)病植株表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量幾乎都多于發(fā)病植株，僅在生物過程中的生物調(diào)節(jié)、生長、生物過程的調(diào)控和應(yīng)激響應(yīng)過程發(fā)病植株表達(dá)的蛋白數(shù)量多于未發(fā)病植株。發(fā)病植株胞外區(qū)細(xì)胞成分表達(dá)的蛋白質(zhì)數(shù)量比未發(fā)病植株多。未發(fā)病植株表達(dá)的蛋白質(zhì)分子功能以酶調(diào)節(jié)活性和結(jié)構(gòu)分子活性的蛋白質(zhì)數(shù)量居多。

表1 樣品鑒定結(jié)果

圖2 正常植株與發(fā)病植株的GO差異比較

圖3 正常植株與發(fā)病植株COG差異比較

2.4 COG分析

對這些差異蛋白進(jìn)行蛋白相鄰聚簇（COG）分析（圖3）。分析結(jié)果顯示，對于煙草抗青枯病品種DB101，植株發(fā)病以后，分子量大小在50～60 kD之間的相關(guān)蛋白質(zhì)主要在以下方面數(shù)量有所增加：核苷酸的運輸代謝，運輸和代謝的輔酶，翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和合成，翻譯后修飾，蛋白質(zhì)周轉(zhuǎn)、伴侶，次生代謝產(chǎn)物的合成、運輸和代謝，防御機(jī)制等相關(guān)蛋白。除此以外，還有一些未知功能的蛋白質(zhì)在發(fā)病植株中可能對于作物抵御病原微生物的侵?jǐn)_起作用。

2.5 Pathway分析

綜合以上分析結(jié)果，發(fā)病植株中，有2個分子量大小在分子量在50～60 kD之間的蛋白質(zhì)與防御機(jī)制相關(guān)。本研究通過生物信息學(xué)途徑檢測分析其所在的代謝路徑。結(jié)果如圖4和圖5。圖中結(jié)果表明，這2個蛋白在組成剪切體的細(xì)胞核核糖核蛋白的合成和代謝通路中。同時與ABC轉(zhuǎn)運子的合成與代謝也有關(guān)系。

圖4 可能參與青枯病防御機(jī)制的蛋白質(zhì)所在的代謝路徑（1）

圖5 可能參與青枯病防御機(jī)制的蛋白質(zhì)所在的代謝路徑（2）

3 討論

DB101在20世紀(jì)50年代育成于美國，其抗性較穩(wěn)定，是國內(nèi)煙草品種青枯病抗性鑒的抗病對照，然而其抗性機(jī)理卻未得到明確的闡析。本試驗考察田間和人工氣候箱2個不同環(huán)境下，該品種發(fā)病植株在發(fā)病后與未發(fā)病植株相比其蛋白質(zhì)組分的變化趨勢，發(fā)現(xiàn)發(fā)病后植株的蛋白質(zhì)在分子量大小約為50～60 kD之間的部分蛋白發(fā)生明顯的變化；進(jìn)一步應(yīng)用蛋白質(zhì)膠條鑒定技術(shù)對該部分蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定和生物信息學(xué)分析，得到該煙草青枯病抗病品種在抵御病原微生物入侵時基因表達(dá)引起的部分生理生化變化信息。

本試驗僅選擇田間樣品作為蛋白質(zhì)膠條鑒定樣品，原因主要有以下2點：（1）SDS-PAGE指紋圖譜顯示，田間和人工氣候箱兩個不同環(huán)境中，發(fā)病植株與正常植株比較均發(fā)生相同的變化趨勢，即發(fā)病后的植株中分子量大小約為50～60 kD之間的蛋白質(zhì)組分發(fā)生明顯的消減。（2）田間環(huán)境中發(fā)病前后的蛋白質(zhì)變化趨勢雖然與人工氣候箱環(huán)境中的一致，但蛋白質(zhì)數(shù)量明顯比人工氣候箱環(huán)境中的少，因此選擇此環(huán)境中的樣品作為蛋白質(zhì)膠條鑒定對象，以考察在兩個不同環(huán)境中共同存在的煙草植株抵抗青枯病菌的相同蛋白質(zhì)組分變化趨勢。

本試驗針對該品種發(fā)病前后發(fā)生顯著變化的部分蛋白質(zhì)組分進(jìn)行生物信息學(xué)分析，得到2個分子量大小在分子量在50～60 kD之間、與防御機(jī)制相關(guān)的蛋白。該蛋白主要存在于組成剪切體的細(xì)胞核核糖核蛋白的合成和代謝通路中，可能與ABC轉(zhuǎn)運子的合成與代謝也有關(guān)系。植物ABC轉(zhuǎn)運蛋白于1992年被首次報道，在植物生長素的極性轉(zhuǎn)運、脂質(zhì)的降解、外源毒素的解毒、植物抗病和氣孔的功能調(diào)節(jié)等方面起作用[9-10]。水稻ABC1家族被證明參與非生物脅迫應(yīng)答，在逆境脅迫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用[11]。然而，未見關(guān)于該類蛋白是否與青枯病脅迫應(yīng)激響應(yīng)有關(guān)的相應(yīng)報道，因此該問題有待進(jìn)一步深入研究。

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