汪漢成，余 婧，蔡劉體，陸 寧

（貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)山地烤煙品質(zhì)與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550081）

溫度、濕度、接菌量及pH對煙草青枯病菌致病力的影響

汪漢成，余 婧，蔡劉體，陸 寧

（貴州省煙草科學(xué)研究院，煙草行業(yè)山地烤煙品質(zhì)與生態(tài)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴陽 550081）

煙草青枯病菌是土傳病原細(xì)菌，其致病力易受多種因素影響。采用穿刺法接種離體葉片，系統(tǒng)性地研究了溫度、濕度、接菌量和pH對煙草青枯病菌致病力的影響。試驗(yàn)范圍內(nèi)青枯病菌可致病的病原菌數(shù)量為1.3～1.3×108cfu，1.3×108cfu病斑面積最大；致病的溫度范圍為 20～35 ℃，最適為 30～35 ℃，病害潛伏期隨著溫度升高而變短；40%～100%的相對濕度范圍內(nèi)均可發(fā)?。恢虏H范圍為5.0～8.0，最適發(fā)病pH為6.0。影響青枯病菌致病力的關(guān)鍵因子為溫度和pH，濕度不是青枯病發(fā)生的關(guān)鍵因素，結(jié)果為研究煙草青枯病發(fā)生機(jī)制提供了科學(xué)依據(jù)。

青枯病菌；致病力；溫度；濕度；pH

長期以來，煙葉生產(chǎn)受到煙草土傳細(xì)菌性病害煙草青枯病（tobacco bacterial wilt）的危害，其病原菌為茄科雷爾氏菌[Ralstonia solanacearum（Smith 1896，Yabuuchi et al. 1996 emend）]。該病害是典型的維管束病害，煙草根、莖、葉各部位均可被侵染，但主要危害植物的根和莖，病株側(cè)根常變黑腐爛，莖部可見黑色條斑[1-2]。該病于1864年在印度尼西亞首次發(fā)現(xiàn)，此后，迅速擴(kuò)展至主要產(chǎn)煙國家并成為制約煙草生產(chǎn)的重要病害[3-4]，目前在我國主要產(chǎn)煙省區(qū)均有發(fā)生。近年來，由于氣候、土壤酸堿度等方面的原因，該病害在我國的危害范圍逐步擴(kuò)大。

煙草青枯病的發(fā)生是煙草、病原菌、環(huán)境共同作用的結(jié)果，煙草青枯病的發(fā)生與病原菌的致病力密切相關(guān)。致病力是病原菌侵入寄主后引起致病的能力。影響致病力的因素包括溫度、濕度、病原菌的濃度、pH等多個(gè)方面，同時(shí)病原菌菌株間的致病力也存在差異。引起我國煙草青枯病的茄科雷爾氏菌主要為1號(hào)小種3號(hào)生化型（R1Bv3）[5]。已有的研究表明，30 ℃的環(huán)境溫度和81.42%以上的相對濕度比較有利于煙草青枯病的發(fā)生[6]，同時(shí)溫度也會(huì)影響煙草品種對青枯病的抗性[7]；接菌濃度100～1010cfu/mL時(shí)均會(huì)引起番茄青枯病的發(fā)生[8]。目前，煙草青枯病菌可致病的溫度、濕度、病原菌濃度及pH范圍仍不清楚。本文以一株煙草青枯病菌致病力菌株為研究對象，對其可致病的溫度、濕度、病原菌數(shù)量及pH范圍進(jìn)行測定，旨在明確影響煙草青枯病致病力的關(guān)鍵環(huán)境因子，為煙草青枯病發(fā)生機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株與煙株 試驗(yàn)于2017年2—5月在貴州省煙草科學(xué)研究院微生物實(shí)驗(yàn)室開展，煙草青枯病菌（Ralstonia solanacearum）由該實(shí)驗(yàn)室分離鑒定所得。煙草品種為云煙87（Nicotiana tabacum cv.Yunyan 87）。

1.1.2 供試培養(yǎng)基與試劑 煙草青枯病菌的培養(yǎng)使用牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基（NA、NB）[9]、青枯菌專性培養(yǎng)基（SMSA）[10]和（BUG+B）培養(yǎng)基[11]，BUG瓊脂由Biolog公司提供，凍干脫纖維羊血（B）由北京友康基業(yè)生物科技有限公司提供。青枯病菌不同pH下生長采用的代謝板 PM9、接種液IF-0a GN/GP（#72268）和 IF-10b GN/GP（#72266）、染料Mix A（#74221），均購自美國Biolog公司。

1.2 接種量對煙草青枯病菌致病力的影響

將青枯病菌于NB培養(yǎng)液中30 ℃、170 r/min黑暗培養(yǎng)，48 h后吸取5 mL菌液，從中吸取0.5 mL，用無菌水將菌液依次稀釋至 100～10-8。采用 1 mL無菌注射器從 100～10-8的梯度稀釋液中分別吸取0.1 mL菌液，采用“穿刺接菌法”將菌液注射至8葉期煙草離體葉片，每點(diǎn)注射15 μL菌液，以注射同體積的NB培養(yǎng)基為對照，每個(gè)處理重復(fù)4次。接菌后將葉片置于30 ℃、RH 80%、16 h黑暗和8 h光照交替的環(huán)境下培養(yǎng)，72 h后測量病斑的直徑并計(jì)算病斑面積。此外，從100～10-8的梯度稀釋液中分別吸取0.1 mL菌液，分別將其均勻涂布于制備好的SMSA平板上，每處理重復(fù)3次，將接菌后的平板置于30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，72 h后計(jì)數(shù)平板上長出的菌落數(shù)。

1.3 溫度對煙草青枯病菌致病力的影響

將青枯病菌于NB培養(yǎng)液中30 ℃、170 r/min黑暗培養(yǎng)，48 h后吸取1 mL菌液，用無菌水將菌液稀釋，制備107cfu/mL的菌液。采用“穿刺接菌法”將菌液注射至8葉期煙草離體葉片，每點(diǎn)注射15 μL菌液，以注射同體積的NB培養(yǎng)基為對照，每個(gè)處理重復(fù)4次。接菌后將葉片置于RH 80%、16 h黑暗和8 h光照交替、及不同溫度（18、20、25、28、30、35 ℃）的環(huán)境下培養(yǎng)，分別于接菌后24、36、60、84、108和132 h觀察葉片發(fā)病情況，測量病斑的直徑并計(jì)算病斑面積。

1.4 濕度對煙草青枯病菌致病力的影響

參照上述方法制備青枯病菌107cfu/mL的菌液。采用“穿刺接菌法”將菌液注射至8葉期煙草離體葉片，每點(diǎn)注射15 μL，以注射同體積的NB培養(yǎng)基為對照，每個(gè)處理重復(fù)4次。接菌后將葉片置于30 ℃、16 h黑暗和8 h光照交替、及不同相對濕度（40%、60%、80%、100%）的環(huán)境下培養(yǎng)，分別于接菌后72 h觀察葉片發(fā)病情況，測量病斑的直徑并計(jì)算病斑面積。

1.5 pH對煙草青枯病菌致病力的影響

將煙草青枯病菌在BUG+B平板上純化培養(yǎng)2代，參照Biolog革蘭氏陰性細(xì)菌代謝的操作規(guī)程[12]進(jìn)行煙草青枯病菌的不同pH環(huán)境下的生長培養(yǎng)，30 ℃培養(yǎng)5 d后取出培養(yǎng)菌液。用1 mL無菌注射器從pH 3.5～10的菌液中分別吸取0.1 mL菌液，采用“穿刺接菌法”將菌液注射至8葉期煙草離體葉片，每點(diǎn)注射15 μL菌液，以注射同體積的無菌水為對照，每處理重復(fù)4次。接菌后將葉片置于30 ℃、RH 80%、16 h黑暗和8 h光照交替的環(huán)境下培養(yǎng)，72 h后觀察葉片發(fā)病情況，測量病斑的直徑并計(jì)算病斑面積。此外，吸取0.1 mL pH 3.5～10范圍內(nèi)的青枯菌培養(yǎng)液，將菌液用無菌水進(jìn)行梯度稀釋，吸取0.1 mL稀釋液均勻涂布于制備好的SMSA平板上，每處理重復(fù)3次，將接菌后的平板置于30 ℃黑暗條件下培養(yǎng)，72 h后計(jì)數(shù)平板上長出的菌落數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 接菌量對煙草青枯病菌致病力的影響

如表1所示，在烤煙云煙87的離體葉片上，煙草青枯病菌在1.3～1.3×108cfu的接菌范圍內(nèi)均可使煙草葉片致病，接菌量1.3×102cfu 48 h時(shí)，發(fā)病面積可達(dá)0.63 cm2，接菌量不影響病斑擴(kuò)展面積。

2.2 溫度對煙草青枯病菌致病力的影響

結(jié)果如表2所示，煙草離體葉片接菌15 μL的107cfu/mL的菌液，在18～35 ℃的溫度范圍內(nèi)，除18 ℃外，煙草青枯病菌均具有致病力；20 ℃時(shí)，青枯病菌接菌 84 h后才開始使離體葉片發(fā)病；25～30 ℃處理，接菌36 h后葉片開始發(fā)?。?5 ℃處理24 h后葉片就開始發(fā)病。在24～132 h的培養(yǎng)時(shí)間內(nèi)，各溫度處理下的煙草葉片發(fā)病面積均會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸擴(kuò)大。此外，在20～35 ℃的測試溫度范圍內(nèi)，36～132 h各時(shí)離體葉片的發(fā)病面積均隨著溫度的升高而增大。

2.3 濕度對煙草青枯病菌致病力的影響

測定結(jié)果表明，相對濕度 40%、60%、80%和100%的條件下，煙草離體葉片穿刺接種 15 μL的107cfu/mL的菌液，青枯病菌均可使葉片發(fā)病，其平均病斑面積分別為0.87、1.04、0.87和0.95 cm2。

表1 煙草青枯病菌接菌量在煙葉上對其致病力的影響Table 1 Effect of inoculum quantity on Ralstonia solanacearum pathogenicity in tobacco leaf

表2 溫度對煙草青枯病菌在煙葉上致病力的影響Table 2 Effect of temperature on Ralstonia solanacearum pathogenicity in tobacco leaf

2.4 pH對煙草青枯病菌致病力的影響

結(jié)果如表3所示，在pH 3.5～10.0的測試范圍內(nèi)，煙草青枯病菌可生長的pH范圍為5.0～9.0，最適為6.0，pH 3.5～4.5和9.5～10.0的環(huán)境下青枯病菌均不能存活。在相同的接菌體積下，pH 6.0處理的菌落數(shù)量可達(dá)1.4×1010cfu，其次為pH 5.0、7.0、5.5和8.0的處理，pH 8.5和9.0處理的菌落數(shù)最小（1.7×103cfu）。不同pH下的致病力測定結(jié)果（表3）表明，煙草青枯病菌可致病的pH范圍為5.0～8.0，該范圍內(nèi)的離體葉片發(fā)病面積均隨葉片培養(yǎng)時(shí)間的延長而逐漸增大；pH 8.5和pH 9.0的處理，青枯病菌雖能存活，但離體煙草葉片培養(yǎng)120 h內(nèi)均未發(fā)病。

3 討 論

煙草青枯病菌是世界性的土傳病原細(xì)菌，寄主廣，變異強(qiáng)，難以防治。本文以中抗品種云煙 87為材料，采用單因子試驗(yàn)，開展了溫度、濕度、接菌量和pH對煙草青枯病菌致病力影響的系統(tǒng)性研究，獲得了煙草青枯病菌致病的病原菌數(shù)量范圍為1.3～1.3×108cfu，致病的溫度范圍為 20～35 ℃，致病的濕度范圍為 40%～100%，致病的 pH范圍為5.0～8.0。

表3 pH對煙草青枯病菌在煙葉上致病力的影響Table 3 Effect of pH on Ralstonia solanacearum pathogenicity in tobacco leaf

溫度是重要的環(huán)境因素，對植物病原菌的生長和病害的發(fā)生均具有較大的影響。據(jù)報(bào)道番茄青枯病菌在液體培養(yǎng)基中最適生長溫度為 30 ℃[8]，青枯病菌侵染番茄的最低溫度為 22 ℃，且溫度越高病害發(fā)生的潛伏期越短[13]；30 ℃最有利于辣椒青枯病的發(fā)生[14]；大部分青枯病菌菌株在20 ℃以下沒有致病力，但青枯病菌 3號(hào)小種 2號(hào)生化型（R3Bv2）被報(bào)道 18 ℃時(shí)在土豆和番茄上可以致病[15-16]；煙草青枯病菌的可生長溫度范圍為15～43 ℃，28.52 ℃為病原菌在平板上的最適生長溫度，同時(shí) 30 ℃左右為煙草青枯病發(fā)展的最有利溫度[17]；30 ℃和35 ℃時(shí)不同青枯病抗性的煙草品種均會(huì)被青枯病菌侵染[7]。本文采用的離體葉片穿刺接種的方法雖然與上述研究不同，但獲得的煙草青枯病菌致病力溫度范圍同上述報(bào)道基本一致。

煙草青枯病菌是土傳細(xì)菌性病害，土壤pH環(huán)境影響著它的定殖和侵染。據(jù)報(bào)道一些煙草青枯病菌菌株可以存活的pH范圍為5.0～9.5[18]，青枯雷爾氏菌在偏酸和偏堿條件下生長較好[19]。本文所測得的青枯病菌可存活的pH范圍為5.0～9.5，研究結(jié)果與之前報(bào)道一致。MICHEL等[20]報(bào)道了不同類型土壤中不同pH的土壤處理措施對青枯病病情指數(shù)影響，僅在土壤環(huán)境中評價(jià)了青枯病菌的病情指數(shù)與pH的關(guān)系。pH對青枯病菌致病力影響方面未見報(bào)道，本文首次系統(tǒng)性地評價(jià)了pH對青枯病菌致病力的影響。青枯病菌雖然在pH 8.5～9.0的范圍內(nèi)能夠存活，但并不能致病，該結(jié)論為通過改良土壤pH來防控青枯病提供了科學(xué)依據(jù)。

本文發(fā)現(xiàn)濕度和青枯病菌的數(shù)量為煙草青枯病發(fā)生的非必要因素。煙草青枯病菌的環(huán)境適應(yīng)能力較強(qiáng)[18]，可供其生長的營養(yǎng)物質(zhì)范圍廣泛，在無氮的情況下仍然能夠生長[5]。只要溫度合適，該病原菌就能迅速繁殖，在寄主存在的條件下，就能侵染煙草進(jìn)而造成危害。濕度雖不是其致病力的關(guān)鍵因子，但對病害的流行與傳播起到積極作用。

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Effect of Temperature, Relative Humidity, Inoculum Amount and pH on Pathogenicity of Ralstonia solanacearum on Tobacco

WANG Hancheng, YU Jing, CAI Liuti, LU Ning

( Guizhou Academy of Tobacco Science, Upland Flue-cured Tobacco Quality & Ecology Key Laboratory of China Tobacco,Guiyang 550081, China)

Ralstonia solanacearum is a worldwide soil born bacterium on tobacco, and its pathogenicity is affected by many factors but the key factors are still unclear. In this study, the effect of temperature, relative humidity, inoculum amount and pH on pathogenicity of R. solanacearum was systematically analyzed. The method of stab inoculation on detached leaves was used throughout the whole experiment. The results showed that the pathogenic amount of R. solanacearum was between 1.3 cfu and 1.3×108cfu, and the biggest scab in detached tobacco leaves was observed in the treatment of 1.3× 108cfu. The pathogenic temperature of the bacterium was from 20 ℃ to 35 ℃, and the best range was from 30 ℃ to 35 ℃, showing decreased incubation period with the raise of temperature. Tobacco bacterial wilt could happen under the relative humidity range of 40% to 100%, thus humidity was not the key factor for this disease. The pathogenic pH value range was from 5.0 to 8.0, and the best value was around 6.0. In conclusion, temperature and pH value were the key factors for pathogenicity of R. solanacearum. These results provided scientific evidence for occurrence mechanism of tobacco bacterial wilt.

Ralstonia solanacearum; pathogenicity; temperature; humidity; pH

S435.72

1007-5119（2017）05-0008-05 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.002

中國博士后科學(xué)基金資助項(xiàng)目“基于土壤微生物量的煙草青枯病根際微生態(tài)的研究”（2017M610585）；貴州省科技支撐計(jì)劃“侵染裂解煙草青枯菌的噬菌體資源庫構(gòu)建及應(yīng)用研究”（黔科合支撐[2017]2606號(hào)）；中國煙草總公司貴州省公司科技項(xiàng)目“解淀粉芽孢桿菌和煙草青枯病菌的營養(yǎng)需求特性研究”（2013-05）

汪漢成（1982-），男，博士，研究員，從事煙草植保與微生物方面的研究。E-mail：xiaobaiyang126@hotmail.com

2017-05-05

2017-08-04