楊 濤，黎妍妍，鄭 露，黃俊斌，魏小慧，郭 利，袁躍斌，王 瑞，李錫宏*，張雙祥，龍開勛

（1.華中農(nóng)業(yè)大學植物科技學院，湖北省作物病害監(jiān)測和安全控制重點實驗室，武漢430070；2.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030；3.湖北省煙草公司十堰市公司，湖北 十堰 442000；4.湖北省煙草公司襄陽市公司，湖北 襄陽 441100；5.湖北省煙草公司宜昌市公司，湖北 宜昌 443000；6.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445500）

湖北煙區(qū)烤煙赤星病病原鑒定

楊 濤1，黎妍妍2，鄭 露1，黃俊斌1，魏小慧3，郭 利4，袁躍斌5，王 瑞6，李錫宏2*，張雙祥5，龍開勛5

（1.華中農(nóng)業(yè)大學植物科技學院，湖北省作物病害監(jiān)測和安全控制重點實驗室，武漢430070；2.湖北省煙草科學研究院，武漢 430030；3.湖北省煙草公司十堰市公司，湖北 十堰 442000；4.湖北省煙草公司襄陽市公司，湖北 襄陽 441100；5.湖北省煙草公司宜昌市公司，湖北 宜昌 443000；6.湖北省煙草公司恩施州公司，湖北 恩施 445500）

為研究湖北各煙區(qū)煙草赤星病病原菌的種類和地理分布，對湖北煙區(qū)的72株煙草赤星病病原菌進行形態(tài)學觀察，共鑒定出4個種，在此基礎上對其中8個典型菌株的rDNA-ITS和Plasma membrane ATPase（ATPase）基因進行測序分析，從分子水平上進一步證實湖北煙區(qū)煙草赤星病為鏈格孢（Alternaria alternata）、長柄鏈格孢（A. longipes）、細極鏈格孢（A.tenuissima）和鴨梨鏈格孢（A. yaliinficiens）侵染所致。其中A. longipes廣泛分布于湖北各煙區(qū)，是優(yōu)勢種群，占69%；A.tenuissima和A. alternata分布在宜昌、十堰、恩施3個煙區(qū)；A. yaliinficiens僅在恩施區(qū)域零星分布，約占3%。該試驗也證實了ATPase基因可以用來作為煙草赤星病病原的輔助鑒定。

煙草赤星?。绘湼矜?；病原鑒定

煙草赤星病是由鏈格孢屬真菌引起的煙葉生長后期主要的葉部真菌性病害，是世界煙草生產(chǎn)上威脅最大的病害之一[1]。煙草赤星病在我國各煙區(qū)均有發(fā)生，以黑龍江、山東、河南、安徽、湖南、廣西、貴州等省區(qū)發(fā)生為害較重。一般煙田發(fā)病率為5%～10%，重病田可達20%甚至50%以上[2]。湖北省常年種植煙草3萬hm2以上，近年來煙草赤星病已經(jīng)發(fā)展為湖北煙區(qū)的主要病害之一，且有逐年加重的趨勢。

以往研究主要通過種植抗性煙草品種、調(diào)整施肥量和移栽期、施用藥劑等措施進行煙草赤星病的防治[3]。在病害綜合治理過程中，對致病菌進行病原鑒定是病害防治的前提和基礎。目前已知引起煙草赤星病的鏈格孢種類有 Alternaria alternata、A.longipes、A. tenuissim、A. yaliinficiens和河南省發(fā)現(xiàn)的一個新種A. tabacicola[4]，國內(nèi)鑒定煙草赤星病病原菌主要采用產(chǎn)孢表型、分生孢子等形態(tài)學指標[5-6]，在分子鑒定方面主要采用rDNA-ITS、Gpd、OPA2-1、ACT等基因進行分子輔助鑒定，這些基因被證實在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的煙草赤星病病原菌種間的差異不顯著[4]，而國外采用的Plasma membrane ATPase基因被證實在鏈格孢種間差異明顯[7]，可以用作對煙草赤星病的鑒定。本試驗采用單孢分離方法對病原菌進行了分離、培養(yǎng)、純化和致病力測定，參照目前鏈格孢種鑒定采用的形態(tài)指標[8]，結(jié)合多基因位點序列[7]，對湖北省煙草赤星病病原菌進行了系統(tǒng)發(fā)育分析，旨在探明湖北省內(nèi)各煙區(qū)煙草赤星病菌的種類和分布情況，為煙草赤星病的科學防治和抗病育種工作奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 煙草赤星病病樣采集

2016年6—10 月從湖北省十堰、襄陽、宜昌、恩施4個市（州）煙草主要種植區(qū)采集煙草赤星病典型病葉，用于分離病原菌。

1.2 實驗試劑和儀器

實驗試劑：PDA培養(yǎng)基（馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL）；PCA培養(yǎng)基（馬鈴薯20 g，胡蘿卜20 g，瓊脂粉15 g，蒸餾水定容至1000 mL）。實驗儀器：PCR儀器、顯微成像系統(tǒng)、打孔器（6 mm）。

1.3 病原菌分離和保存

采用單孢分離法分離煙草赤星病菌。病葉用沾有75%酒精的清潔布擦拭一遍，再用蒸餾水清洗后，置于28 ℃、光暗交替（12 h/12 h）的恒溫培養(yǎng)箱中保濕培養(yǎng)。3 d后將產(chǎn)孢后的病斑放在2%水瓊脂平板上輕輕按壓，將平板倒扣置于顯微鏡下用毛細管針挑取單個分生孢子置于水瓊脂平板，待長出單菌落后保存于濾紙片上，置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 致病性測定

采用漂浮育苗方法播種云煙87，用于病原菌致病性測定。將單孢分離菌株轉(zhuǎn)至 PDA培養(yǎng)基上，置于22 ℃、光暗交替的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。7 d后在菌落邊緣打取直徑為6 mm的菌絲塊，接種保濕放置在育苗盤上 7～10葉期的健康煙草葉片上，在25 ℃、光暗交替（12 h/12 h）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 d后觀察發(fā)病情況，發(fā)病后，從病斑上再次分離病原物，檢測是否與接種菌株相同。試驗重復3次。

1.5 孢子形態(tài)和產(chǎn)孢表型觀察

單孢菌株接種到PCA平板上置于22 ℃、光暗交替（12 h/12 h）的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后，在無菌條件下用滅菌的棉簽刮掉 PCA平板上面的菌絲，置相同培養(yǎng)條件培養(yǎng) 2～5 d，在顯微鏡下觀察產(chǎn)孢表型及分生孢子形態(tài)和大小，采用SIMMONS[7]關于鏈格孢屬的標準鑒定方法進行鑒定。

1.6 煙草赤星病的分子鑒定、PCR擴增和序列測定

單孢菌株在PDA平板上培養(yǎng)5～7 d后，用無菌牙簽挑取少量菌絲，置于1.5 mL離心管中，加入50 μL 10×TE buffer，用微波爐法提取總 DNA[9]，吸取10 μL上清液作為PCR模板。對其核糖體轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（rDNA-ITS）、質(zhì)膜ATP酶（Plasma membrane ATPase）基因片段進行 PCR擴增，所用引物分別為 ITS1（TCCGTAGGTGAACCTGCGC）和 ITS4（TCCTCCGCTTATTGATATGC）、ATPDF1（ATCGTCTCCATGACCGAGTTCG）和ATPDR1[7]（TCCGATGGAGTTCATGATAGCC），反應體系均為50 μL。擴增產(chǎn)物經(jīng)過瓊脂糖凝膠電泳檢測后，對已擴增好的產(chǎn)物委托武漢金開瑞生物技術有限公司進行序列測定。

1.7 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建

將供試8個菌株（YC-WF-750-2、YC-CY-1200-2、SY-ZX-1250-1、ES-LC-1410-5、SY-ZX-1250-2、ES-XF-815-1、ES-BD-1100-1、XY-BK-800-2）測序序列運用DNAStar進行雙向拼接并進行人工校對，得到可信序列。將供試菌株所得序列置于GenBank中進行Blast比對，并從GenBank中下載相關標準菌株序列（表1），將下載的標準菌株序列和測序結(jié)果進行多序列比對，并對兩個基因序列進行連接合并，A. infectoria設為組外對照，序列比對和連接結(jié)果在MEGA7.0 中采用鄰近法（Neighbor Joining，NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（自檢1000次）。

表1 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹所用菌株的種類及GenBank登錄號Table 1 Species for the construction of phylogenetic trees for phylogenetic trees, and GenBank accession number

2 結(jié) 果

2.1 湖北省煙草赤星病病原菌菌株分離和致病性測定

對分離培養(yǎng)純化的 72株煙草赤星病菌株進行了致病性測定，發(fā)現(xiàn)所有菌株均可引起健康煙草葉片發(fā)?。▓D1C-D），對照組未見發(fā)病。

2.2 煙草赤星病菌的形態(tài)學鑒定

圖1 煙草赤星病田間發(fā)病癥狀(A)、成熟葉片局部癥狀(B)、菌株XY-BK-800-2(C)和SY-FX-700-1(D)致病性檢測癥狀Fig. 1 The symptoms of tobacco brown spot in field (A), the local symptoms of mature leaves (B), the pathogenicity of the strains XY-BK-800-2(C) and SY-FX-700-1 (D)

表2 4種鏈格孢在PDA培養(yǎng)基上觀察到的菌落形態(tài)特征Table 2 Colorectal characteristics of the four Alternaria species on PDA medium

表3 4種鏈格孢在PCA培養(yǎng)基上觀察到的形態(tài)特征Table 3 Morphological characteristics of the four Alternaria species on PCA medium

表4 湖北省煙草赤星病病原菌形態(tài)學鑒定結(jié)果Table 4 Morphological identification of tobacco brown spot in Hubei Province

以SIMMONS[8]、張?zhí)煊頪10]的分類標準為依據(jù)，同時參照祖艷青[4]和嚴進[14]對鴨梨鏈格孢的鑒定，通過觀察菌株的菌落形態(tài)（表2）、產(chǎn)孢表型和分生孢子梗形狀以及分生孢子形狀、大小、隔膜等特征（表3），對72株煙草赤星病病原菌的菌株進行了形態(tài)學鑒定（表4）。湖北省煙草赤星病病原菌鑒定為4個種，分別是Alternaria alternata、A. longipes 、A. tenuissima和A. yaliinficiens。各鏈格孢種在菌落、產(chǎn)孢鏈、分生孢子等方面呈現(xiàn)不同的形態(tài)。其中Alternaria longipes（圖2 A、E、J）和A. tenuissima（圖2 D、H、M）產(chǎn)孢鏈都是直鏈，少有分支；但A. longipes在PDA培養(yǎng)基上菌落生長速度緩慢，孢子多倒棍棒狀，少數(shù)橢圓形和卵圓形，大部分孢子頂端常延伸，形成長至40～70 μm的次生分生孢子梗（假喙），假喙向孢身過度處孢壁變薄，至上部顏色變淡；A. tenuissima成熟分生孢子孢身中部常有一顏色加深的橫隔膜，且縮隘更明顯。A. alternata（圖2B、F、K）和A. yaliinficiens（圖2 C、G、L）產(chǎn)孢鏈都有大量分支；但A. alternata形成的產(chǎn)孢鏈多矮樹狀，主鏈和支鏈孢子數(shù)量相差不大；A.yaliinficiens主鏈孢子數(shù)明顯多于支鏈孢子數(shù)，且孢子多是卵形或橢圓形。

圖2 A. longipes的菌落形態(tài)(A)、產(chǎn)孢表型(E)和孢子形態(tài)(J)；A. alternata的菌落形態(tài)(B)、產(chǎn)孢表型(F)和孢子形態(tài)(K)；A. yaliinficiens的菌落形態(tài)(C)、產(chǎn)孢表型(G)和孢子形態(tài)(L)；A tenuissima的菌落形態(tài)(D)、產(chǎn)孢表型(H)和孢子形態(tài)(M)，標尺：E-M=50 μmFig. 2 Colony morphology (A), sporulation phenotype (E) and spore morphology (J) of A. longipes; colony morphology (B),sporulation phenotype (F) and spore morphology (K) of A. alternata; colony morphology (C), sporulation phenotype (G) and spore morphology (L) of A. yaliinficiens; colony morphology(D), sporulation phenotype (H) and spore morphology (M) of A tenuissima,scale: E-M=50 μm

2.3 4種鏈格孢致病菌在湖北的地理分布

根據(jù)病原菌的形態(tài)學鑒定，在所有鑒定的菌株中，Alternaria longipes是優(yōu)勢種，經(jīng)鑒定有50株，占所有菌株的69%（圖3），在湖北4個煙區(qū)以及各海拔高度均有分布。A. alternata有12株，占17%；A. tenuissima有8株，占11%；兩個小種在宜昌、十堰、恩施 3個煙區(qū)的各海拔煙田都有分布。A.yaliinficiens經(jīng)鑒定有2株，所占比例為3%，僅分布于恩施煙區(qū)。

2.4 4種鏈格孢多基因位點序列分析

圖3 各小種所占數(shù)量比例Fig. 3 The proportion of the number of each species

為了進一步證實形態(tài)學鑒定結(jié)果的準確性，從每個鏈格孢種挑選出2個代表菌株共8個菌株進行了rDNA-ITS和Plasma membrane ATPase基因擴增測序，分別獲得了532～544 bp和1143～1265 bp大小的序列。基于rDNA-ITS、ATPase基因序列構(gòu)建的NJ（Neighbor Joining）系統(tǒng)發(fā)育樹表明（圖4），形態(tài)學鑒定為A. alternata的菌株YC-WF-750-2、YC-CY-1200-2與標準菌株EGS 34-016（A. alternata）聚在一個分支；形態(tài)學上鑒定為A. longipes的菌株SY-ZX-1250-1、XY-BK-800-2與標準菌株 EGS 30-033（A. longipes）聚在一個分支；形態(tài)學上鑒定為 A. tenuissima的菌株 ES-LC-1410-5、SY-ZX-1250-2和標準菌株X1309（A. tenuissima）聚在一個分支；形態(tài)學鑒定為A. yaliinficiens的菌株ES-XF-815-1、ES-BD-1100-1單獨聚在一個分支。

圖4 基于rDNA-ITS，ATPase基因序列構(gòu)建的NJ（Neighbor Joining）系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 4 The NJ (Neighbor Joining) phylogenetic tree constructed based on rDNA-ITS and ATPase gene sequence

3 討 論

本研究通過形態(tài)學鑒定和rDNA-ITS及Plasma membrane ATPase測定及分析，證實引起湖北煙區(qū)煙草赤星病病原菌的組成為 Alternaria tenuissima、Alternaria. alternata、Alternaria. longipes、Alternaria.Yaliinficiens 4個鏈格孢種；其中A. longipes是優(yōu)勢種，占總數(shù)的69%。據(jù)報道這4種鏈格孢菌能廣泛引起全國各個煙葉種植區(qū)煙草赤星病害，其中 A.alternata和A. longipes可引起貴州煙草赤星病[5]，A. tenuissima可引起重慶煙草赤星病[6]等。而河南省分離到的煙草赤星病病原菌除這4個種外，還有一個新種 A. tabacicola[4]。研究表明，煙草上的這 4種鏈格孢病原菌也能引起其他農(nóng)林作物減產(chǎn)，A.tenuissima能引起玉米葉枯病[12]，A. alternata、A.tenuissima不僅能引起核桃發(fā)病[13]，還能引起鴨梨貯藏期發(fā)病[14]等。本研究利用形態(tài)學和分子生物學手段對鏈格孢致病菌種類進行了準確鑒定，為病原菌的變異和病害流行規(guī)律理論和基礎。

4個種在湖北煙區(qū)的各區(qū)域分布略有差異。恩施煙區(qū)種類組成復雜，4個種都有；宜昌和十堰煙區(qū)分離的菌株包含了A. alternata、A. longipes、A.tenuissima 3個種；襄陽煙區(qū)僅分離到 A. longipes一個種。據(jù)萬科等[15]對貴州、關博元等[16]對重慶煙草赤星病的研究結(jié)果表明，不同區(qū)域分離得到的煙草赤星病菌以及不同種的赤星病菌對健康煙葉的致病力存在明顯差異。

在形態(tài)學上，SIMMONS[8]將產(chǎn)孢表型用于鏈格孢的種級分類，認為在孢子形態(tài)相似的情況下，產(chǎn)孢表型的差別更為豐富和明顯。一般認為分生孢子的形狀、大小、分隔狀況、孢子表面的紋飾特點、分生孢子的著生方式、喙的有無和形態(tài)，是鏈格孢種的主要分類標準[17]。菌絲特征、菌落特點、分生孢子梗的形態(tài)、寄主范圍等是種級分類的輔助依據(jù)。不論是主要依據(jù)還是輔助依據(jù)，都有一定程度的變幅，要準確鑒定鏈格孢的種，必須在依據(jù)主要標準的同時，綜合考慮其他標準。

在分子水平上，已經(jīng)報道的引起煙草赤星病的5種鏈格孢菌在rDNA-ITS區(qū)域序列差異不明顯，說明它們在遺傳上是很接近的自然群體。這與胡中會[18]、祖艷青等[4]報道的結(jié)果一致，因此rDNA-ITS區(qū)域不適合用于引起煙草赤星病病原的分子鑒定。近年國外研究鏈格孢分類鑒定廣泛采用的 Plasma membraneATPase基因[19]，本研究中也證實該基因在鏈格孢種間的序列差異明顯，可以作為煙草赤星病不同種的輔助鑒定。

4 結(jié) 論

本研究通過對湖北煙區(qū)煙草赤星病病原菌進行形態(tài)學觀察及典型菌株的 rDNA-ITS和 Plasma membrane ATPase基因測序分析，明確了湖北煙區(qū)煙草赤星病的病原菌種類及其分布，并證實了Plasma membrane ATPase基因可以用來作為煙草赤星病的病原鑒定。引起湖北煙區(qū)煙草赤星病的鏈格孢種有 Alternaria tenuissima、A. alternata、A.longipes、A. yaliinficiens；其中A. longipes是引起湖北煙區(qū)煙草赤星病的優(yōu)勢種，在湖北省各個煙區(qū)均有發(fā)現(xiàn)；A. alternata和A. tenuissima分布在宜昌、十堰、恩施3個煙區(qū)；而A. yaliinficiens只在恩施煙區(qū)有少量的發(fā)現(xiàn)。

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Identification of Pathogens Causing Flue-cured Tobacco Brown Spot in Hubei Province

YANG Tao1, LI Yanyan2, ZHENG Lu1, HUANG Junbin1, WEI Xiaohui3, GUO Li4,YUAN Yuebin5, WANG Rui6, LI Xihong2*, ZHANG Shuangxiang5, LONG Kaixun5
(1. College of Plant Science & Technology of Huazhong Agricultural University, The Key Lab of Plant Pathology of Hubei Province,Wuhan 430070, China; 2. Tobacco Research Institute of Hubei Province, Wuhan 430030, China; 3. Shiyan Tobacco Company of Hubei Province, Shiyan, Hubei 442000, China; 4. Xiangyang Tobacco Company of Hubei Province, Xiangyang, Hubei 441100,China; 5. Yichang Tobacco Company of Hubei Province, Yichang, Hubei 443000, China; 6. Enshi Tobacco Company of Hubei Province, Enshi, Hubei 445500, China)

In order to study the species and geographical distribution of tobacco brown spot disease in tobacco fields of Hubei Province, seventy two isolates causing tobacco brown spot in Hubei Province were identified based on morphology and eight typical isolates were analyzed based on sequences of rDNA-ITS and ATPase. The results showed that the pathogens causing tobacco brown spot in Hubei tobacco areas were identified as Alternaria alternata, A. longipes, A. tenuissima and A. yaliinficiens. Among them, A.longipesis was the dominant species distributed in all tobacco-growing areas in Hubei with a high occurrence of 69%. A. tenuissima and A. alternata were found in three areas of Yichang, Shiyan and Enshi. A. yaliinficiens was only isolated in Enshi. In addition, the results also indicated that ATPase gene sequence comparison could be a useful way to differentiate the four pathogensof tobacco brown spot.

tobacco brown spot; alternaria; pathogen identification

S435.72

1007-5119（2017）05-0032-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.006

湖北省煙草專賣局重點項目“湖北省煙草赤星病生物防治技術研究與應用”（027Y2015-005）

楊 濤（1992-），男，在讀碩士，專業(yè)方向：植物真菌病害。E-mail：1358088452@qq.com。*通信作者，E-mail：lxh885@126.com

2017-07-25

2017-10-05