周文兵，計思貴，李江舟，崔永和，張立猛

（云南省煙草公司玉溪市公司，煙草行業(yè)病蟲害生物防治工程研究中心，云南 玉溪 653100）

心葉煙中一類抗煙草普通花葉病毒病活性生物堿

周文兵，計思貴，李江舟，崔永和，張立猛*

（云南省煙草公司玉溪市公司，煙草行業(yè)病蟲害生物防治工程研究中心，云南 玉溪 653100）

煙草普通花葉病毒（TMV）是煙草主要病害之一，利用色譜分離、純化技術(shù)，采用活性追蹤方法，對采自于云南省玉溪市的心葉煙（Nicotiana glutinosa L.）中的化學成分進行系統(tǒng)研究，從中分離得到了12個具有抗TMV活性的生物堿類化合物，其中3個為新化合物（1～3）[(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside，(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside，Lepabisine A]，9個已知化合物（4～12）均為該屬植物中首次分離得到。生物活性測定結(jié)果表明，該類生物堿能夠鈍化煙草普通花葉病毒并抑制其增殖。新化合物1對病毒抑制作用強于對照藥物寧南霉素。該研究首次從煙草中發(fā)現(xiàn)具有抗TMV活性的一類生物堿類化合物，為進一步系統(tǒng)研究煙草內(nèi)源性抗煙草花葉病毒病物質(zhì)提供了科學依據(jù)。

生物堿；心葉煙；煙草普通花葉病毒（TMV）；抑制活性

煙草普通花葉病毒（TMV）是世界上最先發(fā)現(xiàn)并確定的病毒，嚴重危害了煙葉的產(chǎn)量和質(zhì)量，給煙農(nóng)造成了巨大的經(jīng)濟損失[1]。由于植物病毒對寄主細胞具有絕對寄生性，病毒傳播方式具有多樣性，而植物缺乏完整的免疫系統(tǒng)，因而高效抗病毒劑的開發(fā)存在極大困難，至今尚未有理想的防治藥劑[2]。目前采用的農(nóng)業(yè)防治措施存在較大局限性，化學防治則易引發(fā)環(huán)保問題，于是人們把目光轉(zhuǎn)向了抗TMV天然產(chǎn)物的研究與開發(fā)[3]。

煙草中的酚類物質(zhì)對多種致病菌和病毒有較強的抑制和殺滅作用[4]，從煙草中發(fā)掘高效、特異的內(nèi)源性抗TMV化學防御物質(zhì)用于煙草自身，不僅可以解決抗病毒藥劑對寄主植物本身的毒害作用，也可以進一步擴寬煙草的使用空間。

本研究利用色譜分離、純化技術(shù)，采用活性追蹤的方法，對采自于云南省玉溪市的心葉煙中的化學成分進行抗TMV系統(tǒng)研究，為進一步開發(fā)利用煙草源抗性物質(zhì)提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 供試植物及藥劑

心葉煙（Nicotiana glutinosa L.）種子由云南煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供，田間植株采集于玉溪市馬橋科研基地，全株自然陰干后粉碎過 40目篩，供提取活性成分使用。半葉枯斑法試驗用煙株為無蟲溫室中漂浮育苗后移栽于高溫滅菌土壤內(nèi)，后挑選6～8片葉齡，且大小、質(zhì)量相似的健康植株供試。

對照藥劑：2%寧南霉素水劑（ningnanmycin AS），黑龍江強爾生化技術(shù)開發(fā)有限公司提供。

1.2 供試病毒

煙草普通花葉病毒（TMV）U1普通株系，由云南省煙草農(nóng)業(yè)科學研究院提供。通過常規(guī)摩擦接種，使其在普通煙K326（Nicotianata tobacum K326）上繁殖，采用Gooding[5]的方法提純。準確量取5 μL提純的TMV，用0.01 mol/L的磷酸鹽緩沖液（PB）稀釋100倍，紫外分光光度計法測定其質(zhì)量濃度為16 mg/mL。于-20 ℃冰箱中保存，臨用前用 0.01 mol/L的PB稀釋至32 μg/mL。

1.3 主要試劑和儀器

TECH X-4熔點儀。Horiba SEPA-300數(shù)字式旋光儀。Bio-Rad FTS-135紅外光譜儀。Shimadzu UV-2401A紫外光譜儀。ESIMS和 EIMS在 VG Autospec-3000質(zhì)譜儀上測定（以甘油或間硝基芐醇為底物）。HREIMS在API Qstar Pulsar質(zhì)譜儀上測定。1D和2D NMR在Bruker AM-400、DRX-500或AV-600核磁共振儀上測定，TMS為內(nèi)標。Agilent 1100分析或半制備型液相色譜儀，色譜柱為Zorbax Eclipse XDB-C18（Agilent，4.6 mm×150 mm，1 mL/min；9.4 mm×250 mm，2 mL/min），二極管陣列檢測器（DAD）。柱層析硅膠（200～300目）和薄層層析硅膠板均為青島裕民源硅膠試劑廠生產(chǎn)。反相填充材料 Lichroprep RP-18（40～63 μm）為 Merk公司生產(chǎn)或日本 Fuji公司生產(chǎn)。MCI填充材料MCI-gel CHP-20P為日本三菱公司生產(chǎn)。凝膠材料Sephadex LH-20為Pharmacia公司生產(chǎn)。生物堿顯色劑為改良的碘化鉍鉀溶液。常規(guī)顯色劑為碘蒸氣和5%～10% H2SO4-EtOH溶液。

1.4 活性成分的提取、分離及結(jié)構(gòu)鑒定

1.4.1 活性成分的提取 稱取樣品粗粉 10 kg，用甲醇（工業(yè)級）滲漏提取至提取液顏色較淺為止，合并濾液后減壓濃縮得浸膏1.3 kg，于 4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4.2 活性成分的分離 將甲醇提取物利用蒸餾水懸濁，分別經(jīng)石油醚、乙酸乙酯和正丁醇萃取，包括水相共得到4個極性部分。利用活體半葉枯斑法[6]，對各組分進行抗 TMV活性測試，其中乙酸乙酯萃取部分表現(xiàn)出較強的抗TMV活性。將該部分采用正相硅膠柱層析分離，用氯仿-甲醇（0:1～8:2）進行梯度洗脫，得到組分 Fr.1～Fr.4，同樣采用活體半葉枯斑法進行活性檢測，發(fā)現(xiàn)Fr.2抗TMV活性最強。將Fr.2用小孔樹脂（MCI）除去大部分色素后，經(jīng)硅膠（200～300目）柱層析，以石油醚-丙酮（10:1～2:1）梯度洗脫得到3個部分Fr.2-1～Fr.2-3。采用活體半葉枯斑法進行活性檢測，發(fā)現(xiàn)Fr.2-2抗TMV活性最強。Fr.2-2經(jīng)反相RP-18色譜柱，以甲醇-水(30%～100%)梯度洗脫，再經(jīng)制備和半制備分離純化得到化合物1 (8 mg)，2 (4 mg)，3 (9 mg)，4 (25 mg)，5 (85 mg)，6 (10 mg)，7 (25 mg)，8 (12 mg)，9 (38 mg)，10 (22 mg)，11 (43 mg)，12 (24 mg)。

1.4.3 結(jié)構(gòu)鑒定 根據(jù)熔點、質(zhì)譜及核磁共振氫譜及碳譜的檢測結(jié)果，并結(jié)合相關(guān)文獻解析得到化合物的結(jié)構(gòu)。

1.5 活性測定

采用半葉枯斑法[6]，在（22±1） ℃下進行，以健康、生長旺盛的 5～6葉期心葉煙為試驗材料?；衔锏墓┰嚌舛染鶠?1 mg/mL，以寧南霉素 20倍稀釋液為對照。

1.5.1 體外鈍化作用 鈍化試驗中，左半葉接種化合物或?qū)幠厦顾嘏c病毒等體積混合液，右半葉接種蒸餾水與病毒等體積混合液（對照）?；衔锖蛯幠厦顾鼐♂?0倍，鈍化時間均為1 h。每處理接種6片葉子，重復3次，3 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)，計算抑制率?？莅咭种坡拾凑?.5.3中公式計算。

1.5.2 抑制TMV初侵染和增殖作用 初侵染試驗中，各處理分別在施藥24 h后接種病毒；增殖試驗中，均在接種病毒后24 h施藥。施藥方式為涂抹法，左半葉涂抹供試藥劑，右半葉為清水對照。每處理接種6片葉子，重復3次，3 d后統(tǒng)計枯斑數(shù)，計算抑制率。枯斑抑制率按照1.5.3中公式計算。

1.5.3 結(jié)果計算及統(tǒng)計方法 室內(nèi)生測試驗中，統(tǒng)計處理和對照的枯斑數(shù)，計算枯斑抑制率：

枯斑抑制率(%)=(對照枯斑數(shù)-處理枯斑數(shù))/對照枯斑數(shù)×100

采用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行數(shù)據(jù)分析處理，用單因素方差分析統(tǒng)計各處理平均數(shù)的差異，LSD法比較各處理間的差異顯著性。

2 結(jié) 果

2.1 活性成分的分離、純化及結(jié)構(gòu)鑒定

采用色譜技術(shù)從心葉煙中分離得到3個新化合物和 9個已知化合物，這些化合物鑒定如下：(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside (1)，(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside (2)，Lepabisine A (3)，Skimmiamine (4)[7]，(S)-Nkolbisine (5)[8]，Nkolbisine (6)[9]，Methylevoxine(7)[10]，Haploperine (8)[8]，Melineurine (9)[11]，Evodine(10)[12]，Evoxoidine (11)[13]，Myrtifoline (12)[14]，具體結(jié)構(gòu)如圖1（*表示新化合物）。

2.1.1 新化合物結(jié)構(gòu)鑒定 化合物1為白色粉末，ESI+MS顯示準分子離子峰510 [M+H]+，13C NMR譜顯示24個碳信號（表1）：4個甲基（δC25.8，26.4，60.0，62.1），2個亞甲基（δC62.5，71.2），10個次甲基（δC71.4，75.7，77.9，78.0，86.3，106.2，106.3，114.3，119.6，144.3），8個季碳（δC73.7，103.2，115.8，152.9，141.9，142.6，159.0，165.9），結(jié)合其二維核磁共振譜圖數(shù)據(jù)，可以確定分子式為C24H31NO11，不飽和度為10。

由1H NMR譜δH4.55 (1H，d，7.8)，3.24 (1H，m)，3.28 (1H，m)，3.33 (1H，m)，3.28 (1H，m)，3.68 (1H，dd，11.6，4.4)，3.60 (1H，dd，11.6，4.4)及13C NMR 譜δC106.2 (d) 75.7 (d) 78.0 (d)；71.4 (d)；77.9 (d)，62.5 (t)推測該化合物含糖，經(jīng)比對發(fā)現(xiàn)該化合物糖部分化學位移值與葡萄糖基本一致，推測1可能是苷元與葡萄糖成苷。

將 1的苷元部分各化學位移值與(S)-Nkolbisine[8]的波譜數(shù)據(jù)進行比對，發(fā)現(xiàn) 1的苷元部分與(S)-Nkolbisine的數(shù)據(jù)基本吻合，但在C-2'處的化學位移值不同。應用 HMQC對碳氫數(shù)據(jù)歸屬后，在HMBC中可觀察到H-Glc-1'（δH4.55，1H，d，J=7.8 Hz)與 C-2'（δC86.3）的相關(guān)信號（圖 2）。

以上信息說明化合物1中的葡萄糖C-1與苷元的C-2'相連。這樣就確定了該化合物的平面結(jié)構(gòu)。

圖1 化合物1～12的結(jié)構(gòu)Fig. 1 Structures of 1-12

表1 化合物1和2 NMR數(shù)據(jù)（溶劑為 CD3OD）Table 1 NMR data of 1 and 2 (in CD3OD)

化合物 1經(jīng)過水解后得到苷元部分和糖部分，經(jīng)分離測定苷元 CD 數(shù)據(jù)[245 (Δε+4.51)，220 (Δε+0.32) nm]，發(fā)現(xiàn)與(S)-Nkolbisine[8]基本一致，說明二者構(gòu)型相同，同時得到的糖在HPLC上保留時間與β-D型葡萄糖一致。至此確定了化合物1的結(jié)構(gòu)（圖 3），命名為(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside。

把化合物2的NMR數(shù)據(jù)與化合物1進行比較發(fā)現(xiàn)兩個化合物的數(shù)據(jù)基本一致，僅在連糖的2'位和糖的1位化學位移值存在較大差異。在1中2'位和糖的 1位上的碳氫化學位移值分別為δC86.3，106.2和δH3.90，4.55；而在2中2'位和糖的1位上的碳氫化學位移值則分別為δC83.9，103.6和δH4.12，4.83；說明化合物1和2的2'位構(gòu)型不同，這樣我們確定了化合物 2的結(jié)構(gòu)，如圖 3，命名為(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside。

化合物 3為白色粉末，通過其高分辨質(zhì)譜HREIMS m/z 351.1312 [M]+(C17H21NO7, 351.131 8)，和一維和二維核磁共振譜圖數(shù)據(jù)（表2），可以確定分子式為C17H21NO7，不飽和度為8。其13C NMR譜顯示 17個碳信號：4個甲基（δC24.9，26.5，53.1，60.0），1個亞甲基（δC66.8），5個次甲基（δC77.0，106.9，123.2，138.9，146.7），7個季碳（δC72.5，110.3，120.4，160.5，164.0，167.1，167.4），從這些數(shù)據(jù)可知，該化合物骨架結(jié)構(gòu)類似 Nkolbisine，但又有差異。

圖2 化合物1和2的主要2D NMR相關(guān)信號Fig. 2 Key 1H-1H COSY () and HMBC (HC)correlations of 1 and 2

圖3 化合物1和2的結(jié)構(gòu)Fig. 3 Structures of 1and 2

通過 HMQC對碳氫數(shù)據(jù)進行歸屬，在1H-1H COSY中可以觀察到H-2'（δH3.37，1H，dd，8.5，2.5）與 H-1'（δH3.90，1H，dd，11.5，8.5和4.20，1H，dd，11.5，2.5）的相關(guān)信號。另外在 HMBC中可以觀察到H-4'和H-5'（δH1.10，3H，s和1.67，3H，s）與C-2'（δC77.0）和C-3'，H-1'與C-4（δC167.1）的相關(guān)信號，說明異戊烯基的存在并連接在C-4位；在HMBC中還可以觀察到H-7（δH7.19，1H，d，11.8）與 C-8（δC123.2），C-9（δC167.4），C-5（δC120.4），C-4（δC167.1），C-6（δC160.5）的相關(guān)信號；H-β（7.28，1H，d，2.6）與 C-2（δC164.0），C-3（δC110.3），C-α（δC146.7）的相關(guān)信號，根據(jù)這些信息基本可以確定該化合物的平面結(jié)構(gòu)，如圖4；根據(jù)H-7和H-8的耦合常數(shù)（11.8）可知該雙鍵為E式。通過這些分析我們最后確定了3的結(jié)構(gòu)，該化合物為一新化合物，命名為 lepabisine A。2.1.2 化合物理化數(shù)據(jù) （1）(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside：白色粉末，C24H31NO11。1H NMR (400 MHz, CD3OD) and13C NMR（100 MHz，CD3OD）（表 1），ESI+MS：510 [M+H]+，532 [M+Na]+，1041[2M+Na]+，ESI-MS：508 [M-H]-。

（2）(R)-Nkolbisine-β-D-glucoside：白色粉末，C24H31NO11。1H NMR (400 MHz, CD3OD) and13C NMR (100 MHz, CD3OD)（表 1）；ESI+MS: 510[M+H]+，532 [M+Na]+，1041 [2M+Na]+，苷元 CD (c 0.08，MeOH)：λ (Δε) 220 (0.32)，245 (4.51)。

（3）Lepabisine A：白色粉末；[α]22.8D+0.6 (c 0.10,MeOH)；UV (MeOH) λmax(logε) 204 (4.46)，251(4.05) nm；CD (c 0.13， MeOH) λ (Δε) 195 (3.5)，225 (-0.9)，nm，IR (KBr) νmax3429，2954，1726，1638，1571，1376，1276，1171，1096，1053 cm-1；1H NMR(500 MHz，CD3OD) and13C NMR (100 MHz，CD3OD)（表 2）；HREIMS m/z 351.1312 [M]+(calcd.for C17H21NO7，351.1318)。

化合物4-12理化數(shù)據(jù)見文獻[7-14]。

2.2 各化合物生物活性測定

2.2.1 各化合物對TMV體外鈍化作用 表3表明，部分化合物對TMV病毒粒子具有強烈的體外鈍化活性，3個新化合物1～3和已知化合物4的抑制率均大于80%；在相同濃度和鈍化時間下，化合物1和6表現(xiàn)出與寧南霉素相近的活性。

表2 化合物3的NMR數(shù)據(jù)（溶劑為 CD3OD）Table 2 NMR data of 3 (in CD3OD)

圖4 化合物3的結(jié)構(gòu)及其主要2D NMR相關(guān)信號Fig. 4 The structure and key 1H-1H COSY () and HMBC (H C) correlations of 3

表3 各化合物對TMV的鈍化作用Table 3 Inhibiting effects of compounds on TMV

2.2.2 各化合物對TMV初侵染的抑制作用 由表4可看出，部分化合物對 TMV初侵染表現(xiàn)出明顯的抑制作用，施藥24 h后接種，新化合物1和2及已知化合物 9處理對 TMV的抑制率分別達到了81.6%、84.1%和78.0%，顯著高于同等濃度對照藥劑寧南霉素處理。

2.2.3 各化合物對TMV復制增殖的抑制作用 從表5可以看出，部分化合物對TMV的復制增殖表現(xiàn)出較好的抑制作用。接種24 h后施藥，化合物1和11對TMV的抑制率分別達到71.5%和75.9%，表現(xiàn)出與同等濃度寧南霉素相近的活性。

表4 各化合物對TMV初侵染的抑制作用Table 4 Protection effects of compounds on primary infection of TMV

表5 各化合物對TMV復制增殖的抑制作用Table 5 Curative effects of compounds on TMV

3 討 論

植物為了自身的生存，在與病原微生物的對抗中，通過多種代謝途徑在體內(nèi)形成一批具有抵抗病原物入侵功能的代謝產(chǎn)物，一般研究認為，這些代謝產(chǎn)物是調(diào)控植物抗病性的重要物質(zhì)基礎(chǔ)[15]。同時，由于這些代謝產(chǎn)物由植物自身合成，因此對自身的細胞毒性較小[16]。

國內(nèi)外研究者對煙草中的代謝產(chǎn)物進行了大量研究，從中發(fā)現(xiàn)了具有抗病毒作用的活性物質(zhì)。研究還發(fā)現(xiàn)，煙草中酚類化合物對清除自由基作用良好，并且富含抗氧化活性[17-18]。流行病學研究表明，抗氧化化合物一般都具有一定的抗病毒活性[19-20]。同時，學者還發(fā)現(xiàn)煙草中含量較高的綠原酸的水解產(chǎn)物咖啡酸具有抑制單純皰疫病毒的功效[21]。德國Free大學EICH教授在研究植物次生代謝物作為抗逆轉(zhuǎn)錄病毒劑時，發(fā)現(xiàn)綠原酸及其衍生物具有較好的抗艾滋病毒（HIV）活性[21]。這些研究是煙草次生代謝產(chǎn)物在人體醫(yī)學上的應用，而對煙草中具有抵抗病原物入侵功能的代謝產(chǎn)物研究甚少。本研究首次從植物防御角度對心葉煙的防御物質(zhì)進行了系統(tǒng)研究，并從中分離得到了一類具有抗煙草普通花葉病毒活性的生物堿，為煙草中抗煙草普通花葉病毒代謝產(chǎn)物的研究提供了物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié) 論

本研究利用活性追蹤法對心葉煙中的抗煙草普通花葉病毒活性物質(zhì)進行了研究，從中分離得到了 12個對煙草普通花葉病毒具有較強抗性的一類生物堿，其中3個為新化合物。用半葉枯斑法測定12個化合物對TMV的抑制作用表明，12個化合物均具有一定的鈍化作用和抑制病毒侵染作用，其中新化合物1對TMV的活體鈍化作用、初侵染、復制增殖的抑制率分別為93.06%、81.55%和71.54%，鈍化作用和初侵染抑制作用均強于對照寧南霉素，顯示了心葉煙中的小分子化合物良好的抗TMV活性。但對其藥劑配制及田間防效還需要進一步研究。

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Study on the Anti-TMV Activity of the Alkaloids from Nicotiana Glutinosa

ZHOU Wenbing, JI Sigui, LI Jiangzhou, CUI Yonghe, ZHANG Limeng*

(Application Technology of Biological Control for Tobacco Diseases and Insect Pests Engineering Research Center of China Tobacco,Yunnan Tobacco Company, Yuxi Branch, Yuxi, Yunnan 653100, China)

Tobacco mosaic virus (TMV) is one of the main diseases of tobacco. The study aims to investigate the anti-TMV activity of chemical compound from tobacco by using Bioassay-guided Method and provide the basis for anti-viral biological pesticides from tobacco. The constituent of anti-TMV activity was isolated from Nicotiana glutinosa in Yuxi by bioassay. A kind of alkaloids that include three new compounds (1-3) [(S)-Nkolbisine-β-D-glucoside, (R)-Nkolbisine-β-D-glucoside, Lepabisine A] and nine known ones (4-12), were isolated from the whole-plant of Nicotiana glutinosa by various chromatographies such as silica gel, Sephadex LH-20, RP-18 column chromatography and HPLC. Their structures were elucidated by spectroscopic methods, including extensive 1D and 2D NMR techniques. These compounds were also evaluated for their anti-tobacco mosaic virus (anti-TMV) activity. The results revealed that compounds 1 exhibited high anti-TMV activity with inhibition rate of 93.1%, 81.6% and 71.5%, respectively.The rates are higher than those of positive control. The other compounds also showed potential anti-TMV activity. This is the first report on the defense chemicals in tobacco, and provides scientific basis for the next systemic research.

alkaloid; Nicotiana glutinosa; tobacco mosaic virus (TMV); inhibitory activity

S435.72

1007-5119（2017）05-0001-07 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.001

中國煙草總公司云南省煙草公司科技計劃項目“煙草內(nèi)源性抗煙草花葉病成分研究”（2015YN11）

周文兵（1983-），男，博士，農(nóng)藝師，主要從事煙草藥用化學成分研究。E-mail：yaowufx2001@163.com*通信作者，E-mail：zlm.d@163.com

2017-05-03

2017-08-25