黃智華，崔永和，計思貴，蘇友波，張立猛*

（1.云南省煙草公司玉溪市公司，煙草行業(yè)病蟲害生物防治工程研究中心，云南 玉溪 653100；2.云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明 650201）

云南烤煙根際土壤PGPR菌株的篩選與鑒定

黃智華1，崔永和1，計思貴1，蘇友波2，張立猛1*

（1.云南省煙草公司玉溪市公司，煙草行業(yè)病蟲害生物防治工程研究中心，云南 玉溪 653100；2.云南農(nóng)業(yè)大學資源與環(huán)境學院，昆明 650201）

為了利用本地PGPR菌株改善云南植煙土壤質量，提高磷、鉀等元素利用率，促進烤煙生長，在云南主要植煙區(qū)采集烤煙根際土壤樣品31個，對根際土壤中的微生物進行分離，篩選和鑒定，共獲得解磷、解鉀或促生菌共773株，進一步篩選獲得到了10株具有較強解磷、解鉀或IAA促生作用的菌株。經(jīng)鑒定發(fā)現(xiàn)10個菌株分別屬于Bacillus（芽孢桿菌屬）、Paenibacillus（類芽孢桿菌屬）、Providencia（普羅威登斯菌屬）。篩選出的PGPR為微生物肥料的開發(fā)提供了優(yōu)質的菌種資源，進一步研究將關注PGPR菌株的混配以及在土壤中的定殖。

烤煙；PGPR；解磷；解鉀；IAA促生

PGPR（植物根際促生細菌）是一類自由生活在土壤或附生于植物根際的可以促進植物生長及礦質營養(yǎng)利用，并能抑制有害微生物的有益菌類。1978年BURR和SCHROTH首次報道了馬鈴薯上的PGPR[1]。PGPR可以固定空氣中的氮氣，溶解土壤中不能被植物直接吸收的磷素，釋放硅酸鹽礦物中的鉀素，而且還可分泌植物生長調(diào)節(jié)物質，促進植物根系生長，增強植物抗病能力。PGPR用作生物肥料的菌種，持續(xù)性好，對非再生能源消耗少，對環(huán)境、食品安全，經(jīng)濟效益高，同時可以改善土壤結構，提高土壤有機質含量，改良鹽堿地，保持農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)的可持續(xù)發(fā)展[2]。

PGPR肥料在小麥[3]、水稻[4]、玉米等農(nóng)作物及蔬菜上的應用效果良好，在烤煙種植中也具有重要價值。王豹祥等[5]報道了施用PGPR菌肥能夠適當減少化肥用量，并改善土壤微生物群落，提高烤煙抗病性。席淑雅等[6]研究發(fā)現(xiàn)烤煙根際促生菌用于烤煙漂浮育苗可明顯提高種子發(fā)芽率、成苗素質和對煙草病害的抗性。吳秉奇等[7]研究發(fā)現(xiàn)從烤煙根際分離的拮抗菌誘導煙株產(chǎn)生系統(tǒng)抗性，增強對病害的防御力，并且能有效防治煙草黑脛病。為了充分研究本地PGPR資源，獲得適用于本地土壤條件和烤煙種植的PGPR菌株，本研究在云南植煙區(qū)采集烤煙根際土壤，篩選鑒定根際土壤中PGPR菌種，為進一步應用PGPR菌提高烤煙品質提供優(yōu)良的菌種資源。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗用化學試劑均為分析純，購自國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 菌株篩選

1.2.1 樣品采集 2015年4—5月在云南主要植煙區(qū)共采集烤煙根際土壤樣品31個，其中玉溪市14個（紅塔區(qū)3個、江川區(qū)2個、澄江縣2個、新平縣2個、峨山縣2個、華寧縣1個、元江2個），普洱市2個，昆明2個，曲靖4個，楚雄2個，大理5個，紅河2個。于烤煙旺長期取樣，連根帶土采集煙株帶回實驗室。

1.2.2 根際土壤懸液的制備 小心去除煙株根系周圍的土壤，切成1 cm左右的小段，取1 g于三角瓶中，加入9 mL滅菌水，靜置20 min后150 r/min振蕩30 min，即得土壤懸浮液。吸取1 mL土壤懸浮液接入裝有9 mL無菌水試管中，用旋轉振蕩器充分振蕩，依次制備得到 10-3、10-4、10-5、10-6、10-7梯度稀釋液，80 ℃水浴30 min。

1.2.3 培養(yǎng)基及參比菌 解無機磷培養(yǎng)基、蒙金娜基礎培養(yǎng)基、解鉀培養(yǎng)基、CRA培養(yǎng)基、LB培養(yǎng)基配制方法見參考文獻[8-10]。在液體培養(yǎng)基成分中添加瓊脂15.0～20.0 g/L制成相應的固體培養(yǎng)基。參比菌種分別為分離自德根貝中的解磷菌株、生物鉀肥中的解鉀菌株和金農(nóng)肥中的IAA分泌菌株。

1.2.4 初步篩選 將土壤懸浮液分別涂布在3種選擇性培養(yǎng)基平板上，置于恒溫培養(yǎng)箱中 28 ℃培養(yǎng)3～5 d。待平板長出菌落后，分別根據(jù)是否顯示解磷圈、菌落形態(tài)是否為油滴狀和是否顯示紅色，挑選解磷、解鉀和IAA分泌菌株，冷凍保存。

1.2.5 定性測試復篩 根據(jù)解磷圈的大小確定解磷能力，根據(jù)解鉀圈的凸起大小確定解鉀能力，根據(jù)菌落紅色的深淺判斷分泌IAA能力。

1.2.6 定量測試復篩 將純化后的菌株接種至各培養(yǎng)基中，在28 ℃、150 r/min條件下培養(yǎng)至菌濃度約為 5×108/mL進行定量復篩。無機解磷菌：取10 mL細菌懸液，加入30 mL去離子水和1 mL H2O2，砂浴鍋上加熱至粘液消失。冷卻后用定量濾紙進行過濾，并定容至100 mL。用鉬銻抗比色法測磷含量。有機解磷菌：將細菌懸液轉移至已滅菌的50 mL離心管中，超聲波破碎細菌細胞（200 W，20 min），在4 ℃下以4000 r/min離心20 min，取上清液5 mL，用鉬銻抗比色法測磷含量。解鉀菌：取5 mL細菌懸液于50 mL小三角瓶中，加入3 mL 30% H2O2，放于砂浴鍋上蒸煮并不斷攪拌，0.5 h后再加入2 mL 30% H2O2，至硅酸鹽細菌粘液消失時取下。過濾至50 mL容量瓶中并定容。利用火焰光度計測定菌液中的鉀含量。IAA促生菌：將細菌懸液5000 r/min離心5 min，取上清液6 mL，加3 mL顯色試劑，室溫顯色30 min后，于540 nm處測定IAA含量。

1.3 菌株鑒定

1.3.1 候選菌株DNA的提取和16s rDNA的序列擴增 采用CTAB/NaCl法分別對候選菌株進行DNA提取，并采用27F和1492R通用引物擴增16s rDNA。

1.3.2 16s rDNA序列測定和分析[11-13]PCR產(chǎn)物的純化和測序由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。將所得序列與NCBI GenBank中核酸數(shù)據(jù)進行BLAST分析，同源性比較及種屬鑒定。應用MEGA軟件進行多序列比對，采用Clustl W進行聚類分析。

1.3.3 形態(tài)觀察 在LB培養(yǎng)基上進行菌株平板劃線，28 ℃培養(yǎng)48 h后進行形態(tài)觀察。

菌株樣品經(jīng)過固定，清洗，干燥，用導電膠粘在12 mm的觀察臺上，噴金后用Phenom電鏡進行掃描電鏡分析。

1.3.4 生理生化分析 生理生化試驗參照伯杰氏細菌鑒定手冊第九版[15]。

2 結 果

2.1 菌株篩選

2.1.1 初步篩選 在云南省主要植煙區(qū)分離得到烤煙根際具有解磷、解鉀或促生作用的菌株共 773株，各地區(qū)分離菌株數(shù)量見表1。

表1 烤煙根際解磷、解鉀或IAA促生菌篩選統(tǒng)計Table 1 Statistics of phosphate-solubilizing,potassium-solubilizing or IAA-producing bacteria screened rom flue-cured tobacco rhizosphere

2.1.2 復篩 通過定性和定量篩選，得到了 10株具有較強解磷、解鉀或促生能力的菌株，各種菌株解磷、解鉀、促生作用的測試結果見表2。

表2 10種菌株的解磷、解鉀、IAA促生能力比較Table 2 Capacity of potassium-dissolving, phosphate solubilizing and IAA secreting of 10 strains

2.2 候選菌株的鑒定

選用細菌通用引物擴增細菌的16s rDNA區(qū)域，對復篩得到的菌株中解磷、解鉀或IAA促生能力較強的10個菌株進行16s rDNA序列擴增（圖1），凝膠中明亮的條帶即16s rDNA。

圖1 細菌 16s rDNA片段瓊脂糖凝膠電泳圖譜（M：分子標記；1～10依次為：X4，X16，X56，X66，BK22，BK38，BK40，BK43，M3，CH65）Fig. 1 Agarose gel electrophoresis of the fragment from the 16s rDNA(M: Marker. 1 to 10: X4, X16, X56, X66, BK22,BK38, BK40, BK43, M3, CH65)

煙草根際分離得到的 10株細菌菌株經(jīng)鑒定后發(fā)現(xiàn)，BK40為Providencia rettgeri（雷氏普羅威登斯菌），M3屬于Paenibacillus（類芽孢桿菌屬），其余 X4、X16、X56、X66、BK22、BK38、BK43、CH65均為 Bacillus（芽孢桿菌屬），集中在Bacillusmegaterium（巨大芽孢桿菌）、Bacillus cereus（蠟狀芽孢桿菌）、Bacillus thuringiensis（蘇云金芽孢桿菌）、Bacillus simplex （簡單芽孢桿菌）、Bacillus amyloliquefaciens（解淀粉芽孢桿菌）和 Bacillus aryabhattai、Bacillus macroides幾個細菌類群（表 3）。

2.3 典型菌株X16、BK38、M3鑒定

2.3.1 形態(tài)特征 各菌株的微觀形態(tài)如圖 2。菌株X16菌體桿狀，1.0～1.2 μm×1.5～2 μm，圓形。在 LB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，表面凸起有光澤，邊緣整齊，質地較粘。

菌株 BK38 菌體桿狀，0.7～0.9 μm×3～4 μm，圓形。在LB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，表面凸起有光澤，邊緣整齊，質地較粘。在LB平板需氧培養(yǎng)24 h，細菌生長旺盛，菌落光滑，濕潤，半透明淡黃色菌落，有氣味。

菌株 M3 菌體桿狀，大小為 0.7～0.9 μm×3～4 μm，橢圓形。在LB培養(yǎng)基上菌落呈乳白色，表面凸起有光澤，邊緣整齊，質地較粘。

圖2 典型菌株的SEM分析Fig. 2 SEM analysis of representative strains obtained from tobacco soil

表 3 烤煙根際菌株16s rDNA序列比對結果Table 3 The comparsion results of bacterial sequences from the GenBank database with the highest similarity to the sequence of 16s rDNA of each indigenous bacteria isolated from tobacco

2.3.2 生化分析 對 X16、BK38和M3進行生化分析并與標準菌株的生化特性對比發(fā)現(xiàn)[14-16]，X16的生化特性與Bacillus megaterium相似，BK38的生化特性與Bacillus macroides相似[17]，M3的生化特性與Paenibacillus相似（表4）。

2.3.3 同源性分析 菌株X16、BK38和M3的16s rDNA測序結果經(jīng)NCBI blast分析，結果顯示分別與 Bacillus megaterium、Bacillus macroides和Paenibacillus同源性為95%、96%、95%，用MEGA5.1軟件建立系統(tǒng)發(fā)育樹如圖3所示。

表4 菌株X16、BK38和M3的生化特征Table 4 Physiological and biochemical characteristics of X16、BK38 and M3 isolates

由系統(tǒng)發(fā)育樹可知，同是芽孢桿菌屬或其近緣屬，但菌株BK38與芽孢桿菌屬中Bacillus macroides的親緣度更接近，菌株X16與芽孢桿菌屬中的巨大芽孢桿菌親緣度更接近，達到95%，且菌株BK38和菌株X16同屬于一個亞種，親緣度明顯高于菌株M3；菌株M3與芽孢桿菌屬中的多粘芽孢桿菌親緣度更接近。結合形態(tài)學分析、生理生化分析和同源分析基本確認BK38為Bacillus macroides，X16和M3有待進一步確認。

3 討 論

土壤質量下降和面源污染已是目前農(nóng)業(yè)面臨的主要問題[18]，其中一個主要的原因就是肥料過量施用。利用微生物肥料提高肥料利用率，降低肥料施用量是改善土壤質量，促進土壤可持續(xù)發(fā)展，解決農(nóng)業(yè)面源污染的有效途徑。微生物肥料在烤煙種植中的作用也受到廣泛的關注[19-20]。獲得優(yōu)良的微生物菌種是開發(fā)微生物肥料的前提。

圖3 以16s rDNA序列為基礎的菌株X16、BK38、M3系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree of X16、BK38 and M3 isolates based on 16s rDNA sequence

根際是植物根系與土壤界面數(shù)毫米范圍內(nèi)，根系、土壤、細菌、真菌、動物等共同作用形成的具有獨特性能的微域環(huán)境，最早由德國科學家LORENZ HILTNER在1904年提出[21]。根際環(huán)境與植物根系相互作用強烈，具有根際效應。根際微生物數(shù)量遠大于非根際土壤，在微生物結構和功能多樣性等方面具有重要特性[22]。其中PGPR具有固氮、解磷、解鉀、分泌抗生素和植物激素、拮抗病原物和促進植物生長等多種功能，是微生物開發(fā)的重要資源[23]。目前，國內(nèi)外報道的 PGPR主要包括 27個屬，其中以芽孢桿菌屬 Bacillus和假單胞菌屬Pseudomonas的種類最多[24]。與煙草相關的 PGPR主要有微桿菌屬 Microbacterium、香味菌屬Myroides、伯克霍爾德氏菌屬Burkholderia、腸桿菌屬 Enterobacter、泛菌屬 Pantoea、克雷伯氏菌屬Klebsiella、土壤桿菌屬 Agrobacterium[25]、假單胞菌屬 Pseudomonas[26]、芽孢桿菌屬 Bacillus[27]。本研究中所鑒定的菌株中大部分屬于Bacillus也符合這一特點。

本項目所篩選獲得的PGPR菌株，分別具有解磷、解鉀或IAA分泌功能，對各種菌株進行混配后，獲得了同時具有解磷、解鉀、分泌IAA功能的微生物菌肥，施入土壤后對烤煙生長具有顯著的促進作用。PGPR能否在土壤中的定殖是PGPR菌肥能否發(fā)揮作用的關鍵。研究表明不同的土壤肥力條件對PGPR的定殖影響較大[28-30]，因此在后續(xù)研究中應針對篩選出的PGPR菌株配套合理的施肥措施。

4 結 論

本研究在云南主要植煙區(qū)采集的烤煙根際土壤中篩選獲得了具有解磷、解鉀或IAA促生功能的菌株共773株，并進一步篩選獲得到了10株具有較強解磷、解鉀或IAA促生作用的菌株。篩選獲得的10株菌株有8株屬于Bacillus（芽孢桿菌屬），1株屬于 Paenibacillus（類芽孢桿菌屬），1株屬于Providencia rettgeri（雷氏普羅威登斯菌）。結合菌種形態(tài)特征、生理生化特性和16s rDNA測序分析，基本確定菌株BK38為Bacillus macrolides。篩選出的PGPR菌株為進一步的混配和微生物肥料的開發(fā)提供了優(yōu)質的菌種資源。

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Isolation and Identification of PGPR Strains from Rhizosphere Soil of Yunnan Flue-cured Tobacco

HUANG Zhihua1, CUI Yonghe1, JI Sigui1, SU Youbo2, ZHANG Limeng1*
(1. Yunnan Tobacco Company, Yuxi Branch, Biological Control for Tobacco Diseases and Insect Pests Engineering Research Center of China Tobacco, Yuxi, Yunnan 653100, China; 2. College of Resource and Environment, Yunnan Agricultural University, Kunming 650201, China)

To improve the quality of tobacco-planting soil, the utilization rate of fertilizer and finally the quality of tobacco in Yunnan Province by local PGPR, rhizosphere soil samples were collected from the main tobacco-planting fields of Yunnan Province.Rhizosphere bacteria were isolated, screened and identified from soil samples. Capacity of potassium-dissolving, phosphate solubilizing and IAA secreting of bacteria were focused. Morphological observation, biochemical analysis and 16s rDNA sequencing were used to identify the species of PGPR candidates. In result, 31 samples of rhizosphere soil were collected from cities of Yuxi,Kunming, Qujing, Honghe, Chuxiong, Dali, and 773 strains of PGPR were isolated from these soil samples. Ten effective strains were obtained after further screening. The strains belongs to Bacillus, Paenibacillus and Providencia. This research provides resource of excellent PGPR strains for further development of microbial fertilizer. Further works will focus on the mixture and colonization research of these PGPR candidates.

flue-cured tobacco; PGPR; phosphorus-solubilizing; potassium-dissolving; IAA-secreting

S435.72

1007-5119（2017）05-0018-06 DOI：10.13496/j.issn.1007-5119.2017.05.004

云南省煙草公司科技計劃項目“烤煙根際解磷解鉀促生菌PGPR的篩選及應用推廣”（2012YN43），“密集種植煙區(qū)土壤保育及煙葉質量提升技術研究與應用”（2017YN17）

黃智華（1987-），男，農(nóng)藝師，博士，主要從事煙草栽培方面研究。E-mail：huangzhihua0930@126.com。*通信作者，E-mail：zlm.d@163.com

2017-05-17

2017-09-11