張 娜，馬 強，陳學偉，徐傳香，安改紅，崔 博，佘曉俊

（軍事醫(yī)學科學院衛(wèi)生學環(huán)境醫(yī)學研究所，天津300050）

當前，隨著社會的發(fā)展，生活節(jié)奏的加快，工作模式的轉(zhuǎn)換和工作壓力的增大，越來越多的人們處于一種潛在的睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）狀態(tài)。持續(xù)性工作狀態(tài)所導致的SD對人的認知功能及工作能力的影響，一直是現(xiàn)代預防醫(yī)學及許多行業(yè)（如航空、航海、救援、運輸、醫(yī)療等）所關(guān)注的問題。有研究顯示，24 h的SD使人的認知能力下降30%～40%，持續(xù)48 h，認知能力下降達60%～70%［1］。

神經(jīng)顆粒素（neurogranin，Ng）是神經(jīng)元特異性的突觸后膜蛋白，在腦內(nèi)主要分布于海馬、前額皮層、紋狀體和杏仁核等與認知功能高度相關(guān)的重要腦區(qū)［2］。大量研究報道，Ng是參與調(diào)控學習記憶過程的一個重要蛋白，參與了學習記憶過程中起核心作用的信號轉(zhuǎn)導以及突觸可塑性的主要調(diào)控環(huán)節(jié)［3］。前期實驗發(fā)現(xiàn)，Ng在SD損害認知功能過程中可能發(fā)揮重要作用［4］。上調(diào)Ng的表達有可能減輕 SD對認知功能的損害。

維生素A（vitamin A，VA）是人體必需的重要微量營養(yǎng)素，它在人體的視覺、免疫、生長發(fā)育及細胞分化等方面發(fā)揮著廣泛的生理學效應。甲狀腺激素（thyroid hormones，TH）具有維持正常生長發(fā)育、促進代謝和產(chǎn)熱、提高神經(jīng)興奮性的作用。最近，有報道VA的活性代謝物-視黃酸（retinol acid，RA）和TH的活性形式-三碘甲腺原氨酸（triiodothyronine，T3）與海馬突觸可塑性和認知功能相關(guān)。進一步研究發(fā)現(xiàn)，RA和T3可通過其相應的核受體調(diào)控Ng基因的表達［5］。因此，本研究觀察在72 h SD時補充RA或T3能否通過上調(diào)Ng的表達進而有效減輕SD對認知功能的損害，為尋找預防或緩解SD損害認知功能的有效措施提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組

健康雄性Wistar大鼠24只，體質(zhì)量180～220 g，由軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供，給予12 h光照／12 h黑暗（光照時間為 6∶00～18∶00），自由飲食及進水，飼養(yǎng)室的溫度 （18～24℃）和濕度 （55%）相對較為恒定。大鼠適應環(huán)境1周后，實驗動物隨機分為4組（n＝6）：即72 h對照組（72 h C組），72 h睡眠剝奪＋生理鹽水組（72 h SD組），72 h睡眠剝奪＋RA組（72 h SD＋RA組）和72 h睡眠剝奪＋T3組（72 h SD＋T3組）。

1.2 動物模型

睡眠剝奪箱［6］由兩個60 cm×20 cm×60 cm有機玻璃箱組成，底部通過一個直徑為46 cm的轉(zhuǎn)盤相連。轉(zhuǎn)盤轉(zhuǎn)速為每圈10 min，SD側(cè)的轉(zhuǎn)盤下底盤中水深2～3 cm，水溫保持在20℃左右，大鼠只能在轉(zhuǎn)盤上活動，瞌睡時轉(zhuǎn)盤和箱側(cè)壁會將其擠下水中，從而達到SD的目的；對照組一側(cè)的轉(zhuǎn)盤下底盤中不放水，大鼠可以在轉(zhuǎn)盤上和底盤中自由活動，保證正常睡眠。其間自由進食、飲水，自然晝夜光照。每次將兩只大鼠稱重后放入睡眠剝奪箱的兩側(cè)，一側(cè)為SD組，另一側(cè)為對照組。干預組的大鼠于SD前一天開始腹腔注射 RA或 T3（150μg／kg），1次／天，持續(xù)4 d。

1.3 曠場實驗

實驗裝置為高50 cm，底邊為100 cm×100 cm的無蓋方箱，底面平均分為25個方格。曠場實驗中，將大鼠置于方箱底面中心，記錄大鼠3 min內(nèi)在箱底的穿行格數(shù)和直立次數(shù)。兩次實驗之間清洗方箱周壁及底面，以免上次動物余留的信息影響下次實驗結(jié)果。

1.4 海馬齒狀回LTP誘發(fā)實驗

大鼠用 20%烏拉坦腹腔注射（1.5 g／kg），待動物麻醉后，固定于腦立體定位儀上，常規(guī)手術(shù)暴露顱骨，記錄電極定位于海馬的齒狀回顆粒細胞層（前囟后 3.5 mm，中縫旁 2.0 mm，硬腦膜下 3.5 mm）；刺激電極定位于同側(cè)海馬穿行通路上（前囟后8.0 mm，中縫旁4.0 mm，硬腦膜下3.0 mm）。實驗開始時，先用中等刺激電壓的單刺激（interval＝30 s，duration＝200μs）誘發(fā)齒狀回產(chǎn)生群峰電位（population spike，PS），記錄至少30 min，使PS幅值達到穩(wěn)定。調(diào)節(jié)刺激電壓，使PS幅值達最大值，再下調(diào)刺激電壓，使PS保持在其最大峰值的50%，固定此刺激電壓。用單刺激，記錄每5 min內(nèi)引出10個PS的平均值，共記錄30 min。然后，用高頻刺激（high frequency stimulation，HFS）：2 s內(nèi) 10次 internal＝5 ms，duratio n＝200μs，trains＝5的復合串刺激，誘發(fā) LTP。HFS之后，再用HFS前的單刺激，記錄每5 min內(nèi)PS的平均值，共記錄60 min。以HFS前5min內(nèi)的PS均值為100%，HFS前后各時間點記錄的PS均值與之比較，以百分數(shù)（%）表示。

1.5 Western blot檢測海馬Ng的蛋白表達

海馬稱重后置于腦組織蛋白提純緩沖液中（20 mmol／L Tris-Hcl pH 7.0，1 mmol／L EDTA，1%Triton-100，0.5%PMSF）低溫勻漿，14 000 r／min離心 15 min，取上清，用BCA法測蛋白含量并分裝，-20℃保存，用于Western blot檢測Ng表達。將提取的腦組織蛋白（10μg）加2×SDS上樣緩沖液（總體積為10 μl）經(jīng)95℃變性10 min；上樣于10%SDS聚丙烯酰胺（Sigma）凝膠中電泳 1.5 h；用半干轉(zhuǎn)膜儀（北京六一）將蛋白轉(zhuǎn)到 PVDF膜（millipore）上，約 60 min。10%脫脂奶粉溶液于室溫封閉1 h，TBST漂洗3次×10 min；加入羊抗人 Ng抗體（1∶500，Santacruz）室溫1 h后 4℃過夜，TBST漂洗 3次 ×10 min；加入HRP-抗羊 IgG（1∶5 000，Santacruz）室溫孵育 1 h，TBST漂洗3次×10 min；加ECL發(fā)光顯色劑，暗室內(nèi)壓片（Kodak）；用洗脫緩沖液洗PVDF膜30 min。同法顯示HRP標記的GAPDH單克隆抗體（1∶10 000，上?？党桑?。

1.6 數(shù)據(jù)處理

所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（s）表示，統(tǒng)計處理用SPSS 13.0軟件進行分析，各組采用單因素方差（one-way ANOVA）分析進行組間比較。

2 結(jié)果

2.1 RA和T3干預對72 h睡眠剝奪大鼠曠場行為的影響

曠場實驗中，72 h SD后，大鼠站立次數(shù)有降低趨勢，穿行格數(shù)顯著降低（P＜0.05）。腹腔注射RA和T3的大鼠較SD組站立次數(shù)有增多趨勢、穿行格數(shù)顯著增加（P＜0.05），接近C組的水平。提示RA和T3可以使72h SD大鼠自發(fā)行為和探究活動增加，緩解了神經(jīng)系統(tǒng)的抑制狀態(tài)（圖1，2）。

2.2 RA和T3干預對72 h睡眠剝奪大鼠海馬齒狀回LTP的影響

高頻刺激前，各組的PS峰幅值無顯著性差異（P＞0.05）。高頻刺激后，PS峰增加幅值均明顯升高，出現(xiàn)LTP。與C組比較，SD組的PS峰升幅較?。≒＜0.05，P＜0.01），腹腔注射 RA和 T3的 SD組，PS峰升幅較SD組顯著增高（P＜0.05），并且與C組無顯著性差異。C組、SD組、SD＋RA組和SD＋T3組的 PS峰幅值分別為171.8%±14.7%，142.2%±5.7%，158.6%±8.1%和 166.1%±9.3%（圖 3）。

Fig.1 Effects of RA and T3 on the rearing number in open field test after 72 h SD in ratss，n＝6）

Fig.2 Effects of RA and T3 on the crossing number in open field test after 72 h SD in ratss，n＝6）

Fig.3 Effects RA and T3 on the LTPin DGof rats after 72 h SD in rats（n＝6）

2.3 RA和T3干預對72 h睡眠剝奪大鼠海馬Ng蛋白表達的影響

Western blot結(jié)果見圖4。72 h SD＋RA組和72 h SD＋T3組大鼠海馬Ng蛋白表達水平較72 h SD組顯著升高（P＜0.05），均與C組無顯著性差異（圖5）。表明腹腔注射RA和T3可以有效上調(diào)SD后海馬中下降的Ng蛋白水平。

Fig.4 Western blot analysis of Ng levels in the hippocampus of rats

Fig.5 Effects of RA and T3 on hippocampus neuronal Ng protein expression after 72 h SD in ratss，n＝6）

3 討論

大量研究表明，SD使機體認知功能明顯受損，如學習、記憶能力下降，反應遲鈍，注意力分散，定向障礙，出現(xiàn)幻覺［7，8］等，但其具體的機制尚未完全闡明。前期研究發(fā)現(xiàn)，Ng及其PKC信號轉(zhuǎn)導途徑有可能是SD損害認知功能的重要機制之一，SD可能通過影響中樞海馬中以Ng為上游調(diào)控子的信號轉(zhuǎn)導通路，進而損害機體的學習記憶功能［4］。據(jù)此，有可能定位進行干預調(diào)控的有效作用靶點，預防和減輕SD對認知功能的危害。

VA是一種有著廣泛生理學和藥理學活性的重要微量營養(yǎng)素，在體內(nèi)主要通過其活性代謝產(chǎn)物RA調(diào)節(jié)其核受體而發(fā)揮作用。有研究顯示RA不僅在中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）的發(fā)育中發(fā)揮重要作用，而且在成人CNS中也發(fā)揮重要作用［9］。海馬中RA含量在大腦各區(qū)位居首位，是RA合成活力非常強的區(qū)域。

RA主要通過兩大類視黃酸受體（retinoic acid receptors，RAR）（a，β，γ）和 （retinoid X receptors，RXR）（a，β，γ）調(diào)控靶基因表達。這些受體是 DNA結(jié)合蛋白，被特殊的類維生素A配體激活后，通過與靶基因特異的啟動序列相互作用引起基因的轉(zhuǎn)錄。在許多表達受RA調(diào)控的基因中，有一些編碼自身的核受體，有一些編碼在突觸可塑性中起重要作用的腦特異性蛋白質(zhì)—Ng［10］?；蚯贸龑嶒灡砻鬟@些受體和某些編碼神經(jīng)蛋白（如Ng）的基因在海馬LTP形成中起重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)在成年嚙齒類動物中，隨著年齡的增長或者食物中VA被剝奪，RAR表達水平明顯下降，而RAR的低表達可使Ng mRNA及Ng蛋白表達水平明顯下降。外源補充RA則可以減輕因衰老或VA缺乏引起的記憶功能減退，并且可以逆轉(zhuǎn)RAR低表達狀態(tài)，進而提高Ng mRNA及Ng的表達。Ling L等研究發(fā)現(xiàn)外源性補充RA可以通過上調(diào)Ng mRNA和蛋白的表達，使腦梗塞的缺血面積明顯減少，促進神經(jīng)功能恢復，發(fā)揮神經(jīng)保護作用。

TH具有多種生理作用，它調(diào)節(jié)著機體正常的行為、認知和神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育，對哺乳動物的腦發(fā)育及其功能成熟具有廣泛而重要的影響。研究發(fā)現(xiàn)，甲狀腺功能紊亂會影響動物海馬發(fā)育期的突觸功能，并且損害甲狀腺功能正常的成年動物學習記憶功能。對甲狀腺切除的成年鼠進行電生理和生化的研究表明，由TH缺乏造成的記憶損傷與海馬CA1區(qū)的LTP損傷有關(guān)。TH常?？刂浦喾N基因的表達，這些基因又調(diào)控著突觸可塑性和記憶形成的各種形式。

JMunoz等篩選大鼠腦的cDNA文庫時發(fā)現(xiàn)一個在TH缺少時mRNA水平明顯降低的神經(jīng)特異性基因—Ng［11］。TH對哺乳動物大腦的發(fā)育有重要的調(diào)節(jié)作用，而Ng基因是首個被發(fā)現(xiàn)由于缺乏TH而在mRNA水平的表達發(fā)生顯著改變的神經(jīng)細胞基因。在發(fā)育的關(guān)鍵時期，Ng的基因表達受TH調(diào)節(jié)，TH能夠影響Ng蛋白在神經(jīng)元內(nèi)的最后積聚量，但不影響其基因的表達方式，且這種調(diào)節(jié)是可逆的。甲狀腺機能減退的大鼠，腦組織內(nèi)的Ng mRNA表達水平明顯下降，這一變化可被外源性給予T3糾正，T3與核受體（T3R）相結(jié)合，然后通過T3應答元件（TRE）與靶基因相結(jié)合共同作為轉(zhuǎn)錄因子啟動基因的表達。對成年甲狀腺功能減退大鼠Ng mRNA表達水平進行的研究發(fā)現(xiàn)，Ng的表達也發(fā)生可逆性的降低：大鼠大腦皮層Ng mRNA水平降低近30%，而在紋狀體中則降低約50%。甲狀腺機能減退后Ng的變化不僅體現(xiàn)在mRNA水平上，在皮層、紋狀體和海馬部位的Ng蛋白均較對照組降低［12］。

據(jù)此，本實驗選取外源性補充RA和T3作為干預因素，觀察二者能否上調(diào)SD后Ng的表達量，以及能否有效緩解或?qū)筍D對大鼠的神經(jīng)行為和LTP的影響。實驗結(jié)果表明腹腔注射RA和T3可以有效地上調(diào)SD后海馬中下降的Ng蛋白量，使大鼠自發(fā)行為和探究活動增加，緩解神經(jīng)系統(tǒng)的抑制狀態(tài)，并且明顯消除或減輕SD對海馬神經(jīng)突觸可塑性和神經(jīng)元興奮性的損傷作用。研究結(jié)果進一步證實Ng在SD損害認知功能中的重要作用并為尋找預防或緩解SD損害認知功能的有效措施提供實驗依據(jù)。

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