劉海平，孔兆偉，胡 揚(yáng)

（1.溫州醫(yī)學(xué)院體育科學(xué)學(xué)院，浙江 溫州325035；2.澳門大學(xué)教育學(xué)院，澳門999078；3.北京體育大學(xué)，北京100084）

長期耐力訓(xùn)練可使機(jī)體心肺功能改善，血液攜氧、運(yùn)氧 能力提高，最終導(dǎo)致機(jī)體有氧運(yùn)動能力提高。機(jī)體對耐力訓(xùn)練適應(yīng)性的變化存在著明顯的個體差異，產(chǎn)生這種差異很大程度上被認(rèn)為與遺傳因素有關(guān)［1，2］。

人類促紅細(xì)胞生成素（erythropoietin，EPO）基因定位于7q22，由4個內(nèi)含子和5個外顯子組成，其編碼EPO蛋白在體內(nèi)主要功能促進(jìn)紅細(xì)胞生成，提高血液的攜氧、運(yùn)氧能力，對改善機(jī)體的運(yùn)動能力及適應(yīng)缺氧環(huán)境是非常有利的。

本文選取位于人類EPO基因3’端的SNP／T3541G多態(tài)位點(diǎn)，研究該位點(diǎn)與有氧耐力訓(xùn)練后生理表型指標(biāo)變化的關(guān)聯(lián)性，探討其作為篩選預(yù)測有氧耐力訓(xùn)練效果的分子遺傳學(xué)標(biāo)記的可能性。

1 材料與方法

1.1 實驗對象

選取102名北方漢族新兵，平均年齡：18.82±0.88歲、平均身高：（171.67±5.82）cm、平均體重：（60.27±6.54）kg，所有士兵入伍前均無系統(tǒng)的訓(xùn)練史。

1.2 實驗方法

1.2.1 有氧耐力訓(xùn)練方案 所有受試者每周3次，每次進(jìn)行5 000 m勻速跑，持續(xù)18周，實驗第1～10周采用95%個體通氣閾強(qiáng)度訓(xùn)練；第10～18周運(yùn)動強(qiáng)度增至105%。所有受試者日常作習(xí)、飲食、活動均保持一致。

1.2.2 生理指標(biāo)測試 所有生理指標(biāo)在18周有氧耐力訓(xùn)練前后各測試 1次。最大攝氧量（maximal oxygen uptake，VO2max）、通氣無氧閾（ventilation aerobic threshold，VT）采用遞增負(fù)荷實驗由氣體代謝儀分析測試（JAEGER Oxygen Analyzer，德國產(chǎn)）；血紅蛋白（hemoglobin，Hb）采用血細(xì)胞計數(shù)儀（COULTER Ac，美國產(chǎn)）測定；身體成分（體重、瘦體重、體脂百分比）采用體成分儀（Tanita-DX200，日本產(chǎn)）測定。

1.2.3 EPO基因 SNP／T3541G解析 依據(jù) NCBI提供的 EPO基因3’端增強(qiáng)子序列，利用Primer Premier 5.0軟件進(jìn)行引物設(shè)計。上引物：5’ACT CTT GGCTTTTCTGTTTTCTGGG 3’；下引物：5’TACTGCGGT GAGGCCTTGAAT GTA G 3’。20μl反應(yīng)體系（mmol／L）：包括 Tris-HCl（pH 8.3）10，KCl 50，MgCl21.5，0.001%明膠，dATP、dCTP、dGTP、dTTP各 200μmol／L，上下引物各 0.5μmol／L，Taq酶 1U，模板 100 ng。PCR擴(kuò)增在Gene Amp 2700進(jìn)行，擴(kuò)增產(chǎn)物為226 bp片段，限制性內(nèi)切酶AccI在 37°C，5 h消化此段擴(kuò)增產(chǎn)物，EB（ethidium bromide）染色，凝膠成像系統(tǒng)紫外光成像（上海復(fù)日）。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計處理

有氧耐力訓(xùn)練前后生理指標(biāo)數(shù)據(jù)以均值±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示，采用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進(jìn)行分析，訓(xùn)練前基因型組間生理指標(biāo)差異用單因素分析（One-Way Anova）處理；基因型組間有氧耐力訓(xùn)練后生理指標(biāo)變化量采用協(xié)方差處理。

2 結(jié)果

EPO基因SNP／T3541G基因型在士兵中的分布頻率經(jīng)卡方檢驗符合Hardy-Weinberg平衡。士兵人群具有群體代表性。

2.1 SNP／T3541G與體成分及Hb關(guān)聯(lián)性

有氧耐力訓(xùn)練前后，SNP／T3541G各基因型受試者的體成分及Hb指標(biāo)變化見表1。耐力訓(xùn)練前，經(jīng)單因素方差分析顯示，不同基因型受試者之間體重與瘦體重存在顯著性差異（P＜0.01，P＜0.05），TT與 TG基因型受試者顯著高于 GG型（P＜0.01）；有氧耐力訓(xùn)練后，經(jīng)協(xié)方差分析顯示，各基因型受試者之間體成分指標(biāo)的變化量無顯著性差異。

各基因型受試者的Hb在有氧訓(xùn)練前、后及前后變化量均無統(tǒng)計學(xué)意義。

Tab.1 Changes of body composition between genotype in SNP／T3541G of EPOgene（ˉx±s）

2.2 SNP／T3541G與有氧運(yùn)動能力關(guān)聯(lián)性

耐力訓(xùn)練前，各基因型受試者之間VO2max存在不同的趨勢（P＜0.10），TG型受試者最高為（3461.18±326.15）ml／min，依次為TT型、GG型，TG、TT與GG型相比有顯著性差異（P＜0.05）。不同基因型受試者之間的rVO2max沒有顯著性差異；訓(xùn)練后，不同基因型受試者之間的VO2max、rVO2max變化量均無顯著性差異（表2）。

SNP／T3541G各基因型受試者耐力訓(xùn)練前、后VT結(jié)果見表2。耐力訓(xùn)練前，各基因型受試者之間VT／VO2、VT／VE有不同趨勢（P＜0.10），GG基因型受試者的 VT／VO2、VT／VE顯著低于 TT型（P＜0.05），GG基因型的 VT／VO2明顯低于 TG基因型 （P＜0.05），各基因型受試者之間 VT／HR和 VT／rVO2等指標(biāo)無統(tǒng)計學(xué)意義；耐力訓(xùn)練后，各基因型受試者之間VT／VE、VT／VO2、VT／rVO2和 VT／HR的變化量均無明顯差異。

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練前，SNP／T3541G與體重和瘦體重有明顯關(guān)聯(lián)性。TT與TG基因型受試者的體重、瘦體重明顯高于GG基因型受試者（P＜0.01），耐力訓(xùn)練后體成分指標(biāo)的變化量與該多態(tài)性無關(guān)聯(lián)。

僅從EPO自身的生物學(xué)功能上看，它對身體成分并無調(diào)節(jié)作用，但從人類基因圖譜上分析，EPO基因與肥胖基因（obese gene，ob）均位于同一染色體—第7號染色體的7q22和7q31。ob基因的表達(dá)產(chǎn)物－瘦素在體內(nèi)的主要生物學(xué)作用是調(diào)節(jié)脂肪的沉積、抑制食欲、減少能量攝入、增加能量消耗和抑制脂肪合成等，因此，SNP／T3541G多態(tài)性與耐力訓(xùn)練前體成分的關(guān)聯(lián)可能是該位點(diǎn)與ob基因上某個影響該基因表達(dá)的多態(tài)位點(diǎn)連鎖不平衡有關(guān)。但這一推論有待于進(jìn)一步證實。

Tab.2 Changes of aerobic ability between genotype in SNP／T3541G of EPOgene（ˉx±s）

本研究發(fā)現(xiàn)，耐力訓(xùn)練前，在 VO2max、VT／VO2和 VT／VE等指標(biāo)上，TG與TT基因型受試者表現(xiàn)出一定的優(yōu)勢，均明顯高于GG基因型，18周耐力訓(xùn)練后，基因型組間在VO2max、VT等指標(biāo)無顯著性差異。此外，本研究未發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)與耐力訓(xùn)練前、后血紅蛋白濃度存在關(guān)聯(lián)。

SNP／T3541G位于EPO基因3’端增強(qiáng)子上。EPO基因增強(qiáng)子位于聚腺嘌呤核苷酸位點(diǎn)下游116 bp，該增強(qiáng)子上的順式調(diào)節(jié)元件對EPO基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)起著非常重要作用。有研究報道，增強(qiáng)子與反式作用因子特異結(jié)合后能使EPO基因表達(dá)提高3～13倍［3］。3’端低氧誘導(dǎo)增強(qiáng)子在功能上劃分3個區(qū)域，第一區(qū)域是HIF-1和另外兩種結(jié)構(gòu)性表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子ATF-1，CREB-1的結(jié)合位點(diǎn)；第二區(qū)域在增強(qiáng)子中間部分，對低氧誘導(dǎo)EPO基因表達(dá)十分重要，第三區(qū)域的核苷酸序列高度保守，與該部位結(jié)合的反式作用因子可能是孤兒受體家族成員，研究發(fā)現(xiàn)肝核因子（HNF-4）與該部分結(jié)合，能明顯上調(diào)EPO基因表達(dá)。許多轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在位于基因序列3 512 bp～3 740 bp間增強(qiáng)子三個功能部位后，提高EPO基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如將EPO基因增強(qiáng)子序列部分轉(zhuǎn)染至Hep3B等細(xì)胞后，可以在低氧或CoCl2刺激下，大量EPO基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

因此，在增強(qiáng)子區(qū)域產(chǎn)生的序列變異均有可能影響EPO基因轉(zhuǎn)錄、表達(dá)。SNP／T3541G與有氧耐力素質(zhì)關(guān)聯(lián)性直接報道較少。但關(guān)于SNP／T3541G與人血漿EPO水平關(guān)聯(lián)性研究發(fā)現(xiàn)，無論漢、藏民族，攜帶TG雜合子基因型的受試者，其血漿EPO水平均高于其它基因型［4］。由此，表明此多態(tài)性位點(diǎn)與EPO生成可能相關(guān)聯(lián)。這與本研究血紅蛋白的變化不一致。提示，訓(xùn)練方案所安排內(nèi)容對SNP／T3541G各基因型刺激可能不夠，未引起機(jī)體產(chǎn)生明顯耐力訓(xùn)練效果，也可能血紅蛋白的生成不但與EPO有關(guān)，還與其它基因，如EPOR等的調(diào)控有關(guān)。

此外，本研究中觀察到EPO基因SNP／T3541G與耐力訓(xùn)練前VO2max及VT指標(biāo)顯示出一定關(guān)聯(lián)性，反映出TG、TT基因型受者在先天耐力素質(zhì)上可能具有一定優(yōu)勢，但這一結(jié)果與耐力訓(xùn)練前各基因型血紅蛋白值并不一致，而與身體成分?jǐn)?shù)據(jù)具有一致性，即 TG、TT基因型 VO2max、VT／VO2高，LBW也高，由此表明影響VO2max的因素不只是血液運(yùn)氧能力，可能還與身體成分因素相關(guān)。SGoya研究報道，身體LBW對肺功能有積極影響，身體脂肪量對肺功能產(chǎn)生消極影響，即LBW超高，機(jī)體肺功能水平超強(qiáng)［5］，這可能會導(dǎo)致有氧工作能力指標(biāo)，如 VO2max、VT／VO2改善。

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