魏 璨，高 君，陳愛東，白淑芝，李宏霞，柳 磊，邵洪江，彭 雪，李梅秀，徐長慶△，李鴻珠△

（1.哈爾濱醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，黑龍江哈爾濱150086；2.哈爾濱市第一醫(yī)院骨一科，黑龍江哈爾濱150010；3.牡丹江醫(yī)學(xué)院紅旗醫(yī)院，黑龍江牡丹江157011）

在原發(fā)性心臟病中，缺血性心臟病的發(fā)病率居首位，其中50%以上都是由心肌缺血／再灌注損傷（myocardial ischemia／reperfusion injury，MI／RI）所引起［1］。大量的動物實驗研究已發(fā)現(xiàn)，MI／RI的發(fā)生與細(xì)胞凋亡密切相關(guān)［2］，缺血／再灌注后心肌細(xì)胞凋亡明顯增加，那么減少心肌細(xì)胞凋亡，則對減輕心肌損傷具有重要的意義。

多巴胺受體（dopamine receptor，DR）屬于七個跨膜區(qū)域組成的G蛋白偶聯(lián)受體家族［3］，主要分布在中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在外周主要分布于腎臟、腸系膜、心臟、血管等。當(dāng)今國內(nèi)外對于DR的研究多集中在精神分裂癥、帕金森病、藥物依賴、胃潰瘍等，心血管系統(tǒng)主要涉及多巴胺對高血壓、充血性心力衰竭等的影響。DR對MI／RI的影響，國內(nèi)外尚未見報道。我們在前期研究中發(fā)現(xiàn)，大鼠離體 MI／RI過程中DR1和DR2的表達是增加的［4］，且在模擬的原代培養(yǎng)乳鼠 MI／RI模型中，DR1激動劑（SKF-38393）可上調(diào)線粒體和死亡受體途徑，促進 MI／RI和細(xì)胞凋亡［5］。有報道，多巴胺D2受體激動劑培高利特能減輕腦缺血／再灌注時海馬神經(jīng)元的凋亡［6］。我們采用原代培養(yǎng)乳鼠心肌細(xì)胞缺氧／再灌注損傷模型，探討DR2激動劑是否在MI／RI誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡中發(fā)揮類似作用，以便為缺血性心臟病的防治提供新思路和新靶點。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

Wistar乳鼠（2～3 d，雄性，8～15 g），由哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供。

1.2 主要試劑

溴麥角環(huán)肽（bromocriptine，Bro）和氟哌啶醇（haloperidol，Hal，Sigma），Western及 IP細(xì)胞裂解液（beyotime），DMEM培養(yǎng)液（Hyclone），RT-PCR試劑盒（Promega），LDH、SOD、MDA測定試劑盒（南京建成），Annexin-V凋亡檢測試劑盒（北京寶賽）等。

1.3 主要器材

高速低溫離心機（Beckman），US-640型紫外分光光度計（Beckman），倒置相差顯微鏡（Olympus），Western blot電泳槽（美國 BIO-RAD），培養(yǎng)箱 MCO-17AICO2（SANYO），S-1300-U凈化工作臺，PCR儀PTC-100（美國）等。

1.4 原代心肌細(xì)胞培養(yǎng)

用70%的酒精浸泡消毒W(wǎng)istar乳鼠，開胸取心，D-Hank’s液清洗2次，剪碎放入10 ml離心管中；加入心肌5倍體積的0.25%胰酶，37℃水浴消化12 min，共消化4～5次；除第一次外，每次收集的細(xì)胞懸液，放入等體積的高糖DMEM培養(yǎng)液終止消化后，1 500 r／min離心 15 min，棄上清，用含 10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液將沉淀吹打為單細(xì)胞懸液，經(jīng)200目篩網(wǎng)過濾去除未消化組織塊。用差速貼壁分離法去除成纖維細(xì)胞，將純化心肌細(xì)胞計數(shù)后，以 5×106cells／cm2接種于培養(yǎng)皿中，37℃、5%CO2條件下孵育培養(yǎng)。隔天換液，取第4天的細(xì)胞進行實驗。

1.5 心肌細(xì)胞缺氧／再灌注損傷模型的建立及分組

1.5.1 模型建立 參照文獻［7］，將高純度氮氣（N2）通入低糖DMEM中飽和30 min，驅(qū)除氧氣，取生長4 d的單層心肌細(xì)胞，換用 N2飽和的低糖DMEM培養(yǎng)液，放入5%CO2的37℃孵箱中培養(yǎng)2 h；再將缺氧后心肌細(xì)胞的培養(yǎng)液換為含10%胎牛血清的高糖DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h。

1.5.2 實驗分組 培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞隨機分為4組（n＝10）：（1）正常對照組（Control）：正常細(xì)胞培養(yǎng)，不做任何處理；（2）缺氧／再灌注組（H／R）：按照上述方法缺氧 2 h，復(fù)氧 24 h；（3）激動劑干預(yù)組（Bro）：同上，在復(fù)氧時加入 Bro（10μmol／L）；（4）抑制劑干預(yù)組（Hal）：復(fù)氧時加入 Hal（10μmol／L）。

1.6 形態(tài)學(xué)觀察及細(xì)胞凋亡檢測

1.6.1 倒置顯微鏡 在倒置顯微鏡下，肉眼觀察不同培養(yǎng)時間、不同因素處理后乳鼠心肌細(xì)胞的形態(tài)變化。

1.6.2 透射電鏡 用0.25%胰酶消化細(xì)胞 4 min，PBS洗滌1次，2 000 r／min離心 10 min后棄上清收集細(xì)胞；4℃，2.5%戊二醛固定；1%鋨酸固定，常規(guī)乙醇、丙酮逐級脫水，環(huán)氧樹脂包埋，超薄切片，鉛鈾雙重染色，透射電鏡下觀察心肌細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)并攝片。

1.6.3 Annexin-V染色檢測凋亡率 取各組心肌細(xì)胞，0.25%胰酶消化，PBS洗滌2次后調(diào)整細(xì)胞密度為1×106cells／L，制成單細(xì)胞懸液；加入由 100μl Binding Buffer和 FITC標(biāo)記的 Annexin-V（20μg／ml）10 μl，室溫避光 30 min；加入 PI（50μg／ml）5μl，避光 5 min；加入400μl Binding Buffer，立即用流式細(xì)胞儀（FACScan）進行定量檢測。

1.7 LDH和SOD活力以及 MDA水平的測定

取各組細(xì)胞的培養(yǎng)液，用考馬斯亮藍(lán)法測定蛋白濃度：標(biāo)準(zhǔn)品為牛血清白蛋白；按試劑盒說明書操作；紫外分光光度計上讀出吸光度（OD）值，計算細(xì)胞的LDH和SOD活力以及MDA水平。

1.8 RT-PCR檢測細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的mRNA水平

1.8.1 心肌細(xì)胞總RNA提取 用 Trizol法提取心肌細(xì)胞總RNA，用A260和A280判斷RNA純度及含量。

1.8.2 DNase I酶處理 RNA RNA 15μl；DNase I 1 μl；10×DNase Ibuffer 5μl；DEPC-H2O29μl；37℃水浴30 min后加入Trizol reagent、氯仿重新提取總RNA。

1.8.3 逆轉(zhuǎn)錄（RT） 反應(yīng) AMV逆轉(zhuǎn)錄酶逆轉(zhuǎn)RNA，合成第一鏈 cDNA，取 RNA 5μl，Oligo dT 1μl，DEPC-H2O 4.5μl，總體積為 10.5μl。70℃水浴 10 min后置于冰上，放入-20℃冰箱保存。

1.8.4 聚合酶鏈反應(yīng)（PCR） 依據(jù)文獻設(shè)計Bcl-2、Fas、Fas-L、caspase-3、caspase-8和 caspase-9的引物（表1）。引物擴增條件：首次循環(huán)為94℃3 min；隨后進行 30次循環(huán)：94℃ 30 s，58℃40 s，72℃ 1 min；進行10次循環(huán)后加入β-actin，72℃終延伸5 min。

Tab.1PCR-primer sequences

1.8.5 PCR產(chǎn)物分析 取8μl產(chǎn)物進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，在凝膠成像系統(tǒng)下拍照，分別用Bcl-2、Fas、Fas-L、caspase-3、caspase-8、caspase-9與β-actin擴增條帶的信號面積之比判斷其mRNA水平。

1.9 Western blot檢測蛋白表達情況

取各組心肌細(xì)胞，PBS洗滌后加入全細(xì)胞裂解液，冰浴 10 min，4℃，12 000 r／min離心 15 min，取上清進行蛋白質(zhì)定量。取50μg蛋白樣品于10%SDSPAGE凝膠電泳；隨后轉(zhuǎn)印于PVDF濾膜上，用5%脫脂奶粉，37℃封閉1 h；用封閉液稀釋一抗，4℃震蕩過夜；TBST稀釋二抗（1／2 000的羊抗兔IgG二抗，堿性磷酸酶標(biāo)記），室溫振蕩孵育2 h；最后顯色，凝膠成像系統(tǒng)下拍照，計算條帶光密度值，蛋白表達水平以其與β-actin光密度比值來表示。

1.10 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗數(shù)據(jù)以均值 ±標(biāo)準(zhǔn)差s）表示，采用SPSS10.1軟件進行統(tǒng)計分析，采用方差分析及配對t檢驗判斷其差異顯著性。

2 結(jié)果

2.1 倒置顯微鏡下細(xì)胞形態(tài)學(xué)變化

正常心肌細(xì)胞原代培養(yǎng)4～6 h后開始貼壁生長，由圓形變?yōu)樗笮位蚨嘟切危诵?，胞漿致密；培養(yǎng)24 h后，細(xì)胞呈團簇狀并同步節(jié)律性收縮。取培養(yǎng)4 d的細(xì)胞進行分組實驗。正常組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)，細(xì)胞生長情況良好；H／R組可見心肌細(xì)胞皺縮，生長分散，心肌細(xì)胞收縮節(jié)律不規(guī)則，貼壁細(xì)胞變圓，部分脫落；加藥孵育24 h后，Bro組心肌細(xì)胞形態(tài)及收縮性等較H／R組有所改善；而 Hal組則變化不顯著（圖 1）。

Fig.1 Morphological changes of neonatal rat cardiomyocytes by inverted microscope（×100）

2.2 透射電鏡下各組心肌細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)改變

正常組：核膜清楚，線粒體結(jié)構(gòu)完好；H／R組：細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)高度凝聚、邊緣化，線粒體腫脹和空泡化；Bro組：核膜結(jié)構(gòu)較完好，染色質(zhì)部分凝聚，少量線粒體空泡化；Hal組：細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚、邊緣化，線粒體空泡化（圖2）。

2.3 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

正常組：心肌細(xì)胞少量凋亡；H／R組：心肌細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.01與對照組比）；Bro組：心肌細(xì)胞凋亡率明顯低于 H／R組（P＜0.01）；Hal組：心肌細(xì)胞凋亡率與H／R組沒有顯著差異（P＞0.05，圖 3）。

Fig.2 Ultrastructure of cardiomyocytes by transmission electron microscopy（×10k）

Fig.3 Apoptosis rate of cardiomyocytes by FCM（n＝4）

2.4 各組LDH、SOD活性和MDA含量的變化

（1）與正常對照組比較：H／R組 LDH活性、MDA含量明顯增加，SOD活性顯著降低（P＜0.01）；（2）與H／R組比較：Bro組LDH活性、MDA含量降低，SOD活性增加（P＜0.01）；Hal組上述指標(biāo)變化不明顯（P＞0.05，表 2）。

Tab.2 Changes of LDH and SOD activity and MDA content in cell medium（ˉx±s，n＝10）

2.5 RT-PCR檢測各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子mRNA水平

按 Trizol提取心肌細(xì)胞總 RNA，測定 OD260／OD280值為1.84，符合實驗標(biāo)準(zhǔn)。RT-PCR的檢測結(jié)果分別以各凋亡相關(guān)因子與β-actin擴增條帶的面積比表示：（1）與正常組相比，H／R組所有凋亡相關(guān)因子表達均增加（P＜0.01）；（2）與 H／R組比較，加入Bro后除Bcl-2表達增加（P＜0.01），其它因子表達都降低（P＜0.05，P＜0.01）；加入 Hal對上述指標(biāo)影響不顯著（P＞0.05，表 3）。

2.6 Western blot檢測各組心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)因子蛋白水平

以凋亡相關(guān)因子與β-actin蛋白條帶面積之比作為觀察參數(shù)，各組凋亡相關(guān)因子的表達規(guī)律與上面mRNA的轉(zhuǎn)錄規(guī)律一致（表4）。

Tab.3 Results analysis of mRNA expression of the factors in cell apoptosiss，n＝6）

Tab.3 Results analysis of mRNA expression of the factors in cell apoptosiss，n＝6）

H／R：Hypoxia／reperfusion；Bro：Dopamine receptor（DR2）agonist；Hal：DR2 antagonist**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs H／R group

?

Tab.4 Results analysis of protein expression of the factors in cell apoptosiss，n＝4）

Tab.4 Results analysis of protein expression of the factors in cell apoptosiss，n＝4）

Cyt C：Cytochrome C**P＜0.01 vs control group；＃＃P＜0.01 vs H／R group

?

3 討論

本實驗通過乳鼠心肌細(xì)胞缺氧／再灌注模擬MI／RI，采用多種方法檢測心肌細(xì)胞損傷和凋亡情況，并觀察DR2激動劑和抑制劑對心肌細(xì)胞缺氧／再灌注所致?lián)p傷的作用并探討其機制。

倒置顯微鏡和透射電鏡觀察顯示，原代培養(yǎng)的乳鼠心肌細(xì)胞在缺氧／再灌注后出現(xiàn)貼壁細(xì)胞變圓，部分脫落；細(xì)胞核固縮，染色質(zhì)凝聚，線粒體腫脹和空泡化；同時，細(xì)胞培養(yǎng)液LDH活性增強。這些均表明缺氧／再灌注導(dǎo)致心肌細(xì)胞發(fā)生明顯的損傷。

LDH外漏程度可反映細(xì)胞受損程度；SOD活性可反映機體清除自由基和抗脂質(zhì)過氧化的能力；MDA含量可反映氧自由基產(chǎn)生和組織的損傷程度。本研究顯示，與正常對照組相比，缺氧／再灌注組培養(yǎng)液中MDA含量明顯增加、SOD活性顯著降低，表明缺氧／再灌注性心肌損傷與自由基生成增多有關(guān)。

大量動物實驗和臨床研究證明，缺血／再灌注心肌存在細(xì)胞凋亡［2］。心肌缺血／再灌注時，鈣超載、氧自由基大量產(chǎn)生、ATP耗竭等，可觸發(fā)細(xì)胞凋亡的發(fā)生［8］。細(xì)胞凋亡的發(fā)生可經(jīng)外部的死亡受體途徑及內(nèi)部的線粒體途徑。Caspase-3是細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵蛋白酶，其活化是凋亡級聯(lián)反應(yīng)關(guān)鍵步驟［9］。上述兩條途徑都是通過激活 caspase-3執(zhí)行凋亡過程?？沟蛲龅鞍譈cl-2可抑制 Cyt C釋放和 caspase激活，進而阻斷凋亡發(fā)生［10］。

Annexin-V是目前檢測細(xì)胞早期凋亡的靈敏指標(biāo)之一。本實驗的流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示：缺氧／再灌注后心肌細(xì)胞凋亡率約增加3倍。同時，RTPCR和Western blot的檢測表明，缺氧／再灌注組Cyt C、caspase-3、caspase-8、caspase-9、Fas和 Fas-L mRNA和蛋白表達均明顯增加，這就進一步證實上述結(jié)論。至于Bcl-2表達增加，可能是機體的一種代償性適應(yīng)性反應(yīng)。

我們前期研究發(fā)現(xiàn)，在 MI／RI過程中 DR1和DR2的表達增加，DR1激動劑可上調(diào)線粒體和死亡受體途徑，促進 MI／RI和細(xì)胞凋亡［4-5］。DR2的活性變化對MI／RI的影響，國內(nèi)外尚未見報道。

Bromocriptine（Bro）是 DR2的激動劑，Haloperidol（Hal）是DR2的抑制劑。本實驗倒置顯微鏡、透射電鏡、流式細(xì)胞儀和生化檢測結(jié)果均顯示：Bro可減輕并抑制心肌缺氧／再灌注誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷和細(xì)胞凋亡以及增強機體的抗氧化能力；而Hal則無明顯影響。分子生物學(xué)檢測結(jié)果顯示，加入Bro可下調(diào)促凋亡因子表達而上調(diào)抑凋亡因子Bcl-2表達。

綜上所述，DR2激活可減輕缺氧／再灌注對心肌細(xì)胞的損傷，其機制與清除自由基、減少脂質(zhì)過氧化和通過Cyt C-caspase-3線粒體途徑和Fas／Fas-L死亡受體途徑抑制心肌細(xì)胞凋亡有關(guān)。結(jié)合我們的前期實驗結(jié)果，激活心肌DR2和抑制DR1有望為缺血性心臟病的防治提供一個新思路和新靶點。

［1］ 歐陽越，張景紅.心肌缺血／再灌注損傷的分子修復(fù)機制及其抑制劑的研究進展［J］.中國醫(yī)藥科學(xué)，2012，2（1）：30-34.

［2］ Scarabelli TM，Knight R，Stephanou A，et al.Clinical implications of apoptosis in ischemic myocardium［J］.Curr Probl Cardiol，2006，31（3）：181-264.

［3］ Gingrich JA，Caron MG.Recent advances in the molecular biology of dopamine receptors［J］.Annu Rev Neurosci，1993，16（6）：299-321.

［4］ 李鴻珠，徐長慶，韓麗萍，等.大鼠心肌多巴胺受體在缺氧-復(fù)氧時表達變化及其意義［J］.中國病理生理雜志，2007，23（12）：2322-2326.

［5］ Li HZ，Han LP，Jiang CM，et al.Effect of dopamine receptor-1 on apoptosis of cultured neonatal rat cardiomyocytes in simulated ischemia／reperfusion［J］.Basic Clin Pharmacol Toxicol，2008，102（3）：329-336.

［6］ 縱艷艷，縱雪梅，許鵬程.多巴胺D1，D2受體激動劑對腦缺血／再灌注損傷的影響［J］.生理學(xué)報，2003，55（5）：565-570.

［7］ 鐘 理，宋治遠(yuǎn).模擬缺血-再灌注誘導(dǎo)原代培養(yǎng)乳鼠竇房結(jié)細(xì)胞凋亡的研究［J］.第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2001，23（1）：59-62.

［8］ 陳天平.心肌缺血再灌注損傷與心肌細(xì)胞凋亡的研究進展［J］.蚌埠醫(yī)學(xué)院學(xué)報，2009，34（12）：1162-1164.

［9］ 廈 天，蔣春筍，李林江，等.呼吸代謝控制在 Caspase-3對線粒體凋亡信號正反饋作用中的機制和意義［J］.科學(xué)通報，2001，46（21）：1791-1796.

［10］李愛英，吉恩生，趙書明.?；撬釋彝萌毖俟嘧⑿募〖?xì)胞凋亡的影響［J］.中國應(yīng)用生理學(xué)雜志，2004，20（3）：224-227.