黃景慧，韓文志，張雁芳，段瑞峰，鄧浩浩，郭玉紅，劉 衛(wèi)，汪 海，2△

（1.軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院衛(wèi)生學(xué)環(huán)境醫(yī)學(xué)研究所心血管藥物研究中心，北京100850；2.北京賽德維康醫(yī)藥研究院，北京100039）

慢性低氧性肺動(dòng)脈高壓（hypoxic pulmonary hypertension，HPH）是一種持續(xù)低氧導(dǎo)致的肺動(dòng)脈壓力持久增高的慢性綜合病癥，最終可因右心室后負(fù)荷增加而導(dǎo)致右心衰竭。盡管HPH發(fā)病機(jī)制尚不清晰，但血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在HPH發(fā)生、發(fā)展的過程中起著關(guān)鍵的作用。病理?xiàng)l件下，由于肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受損，血管舒張因子（nitricoxide，NO）和收縮因子內(nèi)皮素-1（endothelin-1，ET-1）之間的平衡被打破，造成內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)血管平滑肌的調(diào)節(jié)紊亂，血管平滑肌異常增殖，引發(fā)管壁增厚，官腔狹窄等肺微動(dòng)脈重構(gòu)的病理改變［1］。目前，以改善肺阻力血管內(nèi)皮損傷為靶點(diǎn)治療肺動(dòng)脈高壓的藥物雖然一定程度上改善了患者的生存質(zhì)量，但因降壓程度有限，對(duì)低氧暴露的肺阻力血管選擇性差，不能逆轉(zhuǎn)肺微動(dòng)脈重構(gòu)，臨床應(yīng)用受限。因此，研究靶向調(diào)控低氧暴露的肺微動(dòng)脈，強(qiáng)效保護(hù)血管內(nèi)皮活性的治療藥物意義重大。

鉀離子通道開放劑是一類強(qiáng)效的血管擴(kuò)張劑，在治療HPH方面具有較好的研究基礎(chǔ)［2］。埃他卡林（iptkalim，Ipt）是我室自行設(shè)計(jì)、合成的新型 KATP通道開放劑［3］。臨床前的大量藥理學(xué)研究表明埃他卡林降壓作用平穩(wěn)持久；能保護(hù)病理狀態(tài)下心、腎、腦等重要靶器官損傷，逆轉(zhuǎn)心血管重構(gòu)，調(diào)節(jié)多種心血管危險(xiǎn)因素所致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，具有強(qiáng)效內(nèi)皮保護(hù)作用，其分子機(jī)制與其糾正內(nèi)皮細(xì)胞NO和ET-1系統(tǒng)功能的失衡和激活Chemerin／ChemR23系統(tǒng)有關(guān)［4］。我室前期在ET-1誘導(dǎo)的大鼠肺動(dòng)脈高壓模型及模擬 HPH的常壓低氧動(dòng)物模型［5］上均發(fā)現(xiàn)，Ipt可以有效阻止肺動(dòng)脈高壓持續(xù)增高和逆轉(zhuǎn)持續(xù)低氧所致的大鼠肺微動(dòng)脈重構(gòu)。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，利用阻力血管張力研究平臺(tái)［6］，進(jìn)一步探討Ipt對(duì) HPH及醋氮酰胺（acetazolamide，Acz）干預(yù) HPH大鼠肺微動(dòng)脈內(nèi)皮活性及選擇性擴(kuò)張肺微動(dòng)脈作用特征，為Ipt發(fā)展為新型治療HPH的藥物提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及分組

二級(jí)雄性SD大鼠，體重（200±20）g（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物中心提供），分籠飼養(yǎng)，自由飲水、進(jìn)食。隨機(jī)分為3組：對(duì)照組（Control），低氧暴露組（Hypoxia）和低氧暴露＋Acz干預(yù)組（灌胃給予Acz 80 mg／（kg·d））。

1.2 低氧處理

將間歇性低氧暴露組大鼠置于常壓低氧艙內(nèi)，低氧開始時(shí)，先向艙內(nèi)充入氮?dú)猓档团搩?nèi)氧氣含量，艙內(nèi)氧含量由氧濃度監(jiān)測儀（CYES-II；中國上海）監(jiān)測，使之穩(wěn)定于（10±0.5）%，低氧艙有小孔與外界相通，使氧艙大氣壓與外界一致。艙內(nèi)CO2和水蒸氣分別用鈉石灰和無水氯化鈣吸收。間斷低氧（8 h／d，每周 6 d），持續(xù) 12周。

1.3 Ipt對(duì)間歇性低氧暴露預(yù)收縮肺動(dòng)脈模型張力變化測定

將三組大鼠斷頸處死后，迅速取出肺組織置于4℃的含Krebs-Ringer營養(yǎng)液的培養(yǎng)皿中，營養(yǎng)液組分（mmol／L）：NaCl 118.3，KCl 4.7，CaCl22.5，KH2PO41.2，NaHCO325.0，MgSO41.2，EDTA 0.026，Glucose 11.1。固定分離肺組織 4～5級(jí)管徑為（197±4）μm的微動(dòng)脈，制備約2 mm的肺微動(dòng)脈血管環(huán)，記錄微動(dòng)脈管徑。將肺微動(dòng)脈環(huán)懸掛于DMT610m微血管張力測定儀的37℃恒溫浴槽內(nèi)，持續(xù)通入95%O2和5%CO2混和氣，通過Powerlab記錄系統(tǒng)監(jiān)測肺動(dòng)脈環(huán)張力變化。在6 nmol／L內(nèi)皮素-1（ET-1）預(yù)致血管收縮的條件下，選取張力大于3 mN活性良好的肺微動(dòng)脈，累積性給予Ipt（軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院毒物藥物研究所合成、提供，純度＞99.5%）。待每一次給藥濃度的張力示數(shù)穩(wěn)定后再給予下一濃度，觀察不同濃度的藥物對(duì)血管張力的影響并利用乙酰膽堿（ACh）考察肺動(dòng)脈內(nèi)皮活性。以ET-1誘發(fā)最大穩(wěn)定收縮幅度為100%，藥物誘發(fā)血管舒張的幅度與ET-1誘發(fā)最大穩(wěn)定收縮幅度之間的比率為血管的舒張率。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（ˉx±s）表示。運(yùn)用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用單因素方差分析（ANOVA），再進(jìn)行 q檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 間歇性低氧肺微動(dòng)脈內(nèi)皮活性

以6 nmol／L內(nèi)皮素（ET-1）預(yù)收縮肺微動(dòng)脈，模型穩(wěn)定后以10μmol／L ACh檢驗(yàn)間歇性低氧暴露肺微動(dòng)脈內(nèi)皮活性。結(jié)果顯示：與對(duì)照組（control）舒張率（14.76±3.26）%對(duì)比，ACh對(duì)肺微動(dòng)脈舒張率顯著降低（P＜0.01），僅為（4.63±1.82）%，ACh對(duì)80 mg／kg Acz干預(yù)組舒張率為（10.32±2.58）%，與低氧暴露組相比顯著提高（P＜0.05）。提示間歇性低氧暴露導(dǎo)致肺微動(dòng)脈內(nèi)皮活性受損，Acz能夠改善間歇性低氧暴露狀態(tài)肺微動(dòng)脈內(nèi)皮活性（圖1）。

2.2 Ipt對(duì)間歇性低氧肺微動(dòng)脈擴(kuò)張作用影響特征

以6 nmol／L內(nèi)皮素-1（ET-1）預(yù)收縮肺微動(dòng)脈，模型穩(wěn)定后，累積性加入Ipt。結(jié)果顯示，Ipt對(duì)Control組肺動(dòng)脈舒張作用較弱，最大舒張率為（10.03±1.17）%；Ipt對(duì)間歇性低氧暴露組肺動(dòng)脈呈劑量依賴性舒張反應(yīng)，最大舒張率為（24.93±4.34）%，與Control組相比有顯著性差異（P＜0.01）；Ipt對(duì) 80 mg／kg Acz干預(yù)組肺動(dòng)脈也呈劑量依賴性舒張反應(yīng)，最大舒張率為（32.61±7.70）%，與 Control組相比有顯著性差異（P＜0.01）；而間歇性低氧暴露組與80 mg／kg Acz干預(yù)組間無顯著性差異（圖2）。提示 Ipt對(duì)常壓常氧狀態(tài)的肺微動(dòng)脈無明顯舒張作用，而對(duì)低氧狀態(tài)的大鼠肺微動(dòng)脈更敏感，擴(kuò)張作用更強(qiáng)。推測Ipt可能對(duì)低氧誘發(fā)的肺微動(dòng)脈高壓具有保護(hù)作用，80 mg／kg醋氮酰胺干預(yù)不影響Ipt對(duì)肺微動(dòng)脈的擴(kuò)張作用效果。

Fig.1 Acetycholine（ACh）causes vasodilatation in endotheliumintact pulmonary arterioles pre-contracted by 6 nmol／L endothelin-1（ET-1）from hypoxia，acetazolamide and control group（ˉx±s，n＝9）

Fig.2 Concentration-response curves for iptakalim（Ipt）-induced dilatations in pulmonary arterioles pre-contracted by 6 nmol／L ET-1 from hypoxia，acetazolamide and control group（ˉx±s，n＝9）

3 討論

常壓低氧動(dòng)物模型是研究HPH常用的模型系統(tǒng)，持續(xù)低氧導(dǎo)致大鼠肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞受損，喪失產(chǎn)生血管活性物質(zhì)的能力，血管舒張因子（NO）和收縮因子（ET-1）之間的平衡被打破，血管平滑肌異常增殖，引發(fā)血管重構(gòu)及過度收縮，形成肺動(dòng)脈高壓。Acz是一種典型的磺胺類碳酸酐酶抑制劑，常用于急性高原病的治療［7］。文獻(xiàn)報(bào)道慢性給予Acz能夠抑制血液中促紅細(xì)胞生成素，降低紅細(xì)胞比容，提高內(nèi)皮細(xì)胞NO的生物利用度，促進(jìn)低氧性肺動(dòng)脈的舒張［8］。我們應(yīng)用阻力血管張力研究平臺(tái)，發(fā)現(xiàn)ACh對(duì)間歇性低氧暴露肺微動(dòng)脈舒張作用顯著降低，提示血管內(nèi)皮活性受損是HPH發(fā)生發(fā)展過程中的重要標(biāo)志。進(jìn)一步在模擬HPH的80 mg／kg Acz 12周干預(yù)及單純常壓低氧動(dòng)物模型上證明，Acz可以改善肺微動(dòng)脈內(nèi)皮活性。因此，尋找HPH狀態(tài)下靶向肺微動(dòng)脈改善內(nèi)皮活性的藥物具有非常重要的意義。Ipt是我國學(xué)者自行設(shè)計(jì)、合成的新型KATP通道開放劑，在有效降壓的同時(shí)，研究發(fā)現(xiàn)能夠逆轉(zhuǎn)多種心血管危險(xiǎn)因素所致的內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，具有強(qiáng)效內(nèi)皮保護(hù)作用，其分子機(jī)制與其糾正內(nèi)皮細(xì)胞NO和 ET-1系統(tǒng)功能的失衡和激活 Chemerin／ChemR23系統(tǒng)有關(guān)［4］。前期實(shí)驗(yàn)也表明，Ipt可以阻斷ET-1誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓，逆轉(zhuǎn)間歇性低氧所致的動(dòng)物肺動(dòng)脈高壓增高和肺小動(dòng)脈重構(gòu)［5］，提示Ipt可能成為通過改善內(nèi)皮細(xì)胞功能治療HPH的新型候選藥物。

持續(xù)缺氧可減少肺阻力血管鉀通道的開放，鉀離子通道的關(guān)閉是HPH發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。目前，KATP通道被認(rèn)為是研制治療肺動(dòng)脈高壓藥物的重要靶標(biāo)［9］。KATP通道開放劑作為新一類降壓藥物，雖然在治療HPH方面具有一定的療效，然而以代表藥物吡那地爾為例，對(duì)肺微動(dòng)脈缺乏選擇性，并且尚無通過改善血管內(nèi)皮活性逆轉(zhuǎn)間歇性低氧暴露肺微動(dòng)脈重構(gòu)的報(bào)道。Ipt是我國學(xué)者自行設(shè)計(jì)、合成的新型KATP通道開放劑，對(duì)病理狀態(tài)的阻力血管具有高選擇性調(diào)控作用［10］，我們在間歇性低氧暴露的肺微動(dòng)脈收縮模型上發(fā)現(xiàn)，Ipt對(duì)間歇性低氧暴露組及80 mg／kg Acz干預(yù)組肺微動(dòng)脈呈劑量依賴性舒張反應(yīng)，而對(duì)常壓常氧肺微動(dòng)脈無明顯擴(kuò)張作用，提示Ipt對(duì)間歇性低氧暴露及Acz干預(yù)狀態(tài)下的內(nèi)皮活性受損的肺微動(dòng)脈起效濃度低，舒張作用強(qiáng)，具有明顯的病理狀態(tài)選擇性，Acz干預(yù)并不影響Ipt對(duì)肺微動(dòng)脈的選擇性舒張作用效果。

綜合本實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有研究結(jié)果和國內(nèi)外的研究資料，Ipt高選擇性擴(kuò)張間歇性低氧暴露狀態(tài)下內(nèi)皮活性受損的肺微動(dòng)脈，逆轉(zhuǎn)低氧性肺動(dòng)脈高壓和肺血管病理性重構(gòu)的機(jī)制可能在于：激活肺部阻力血管細(xì)胞膜KATP通道，引起細(xì)胞膜超極化，減少平滑肌細(xì)胞膜電壓依賴性鈣通道開放引起的胞內(nèi)Ca2＋增加，松弛血管平滑?。煌ㄟ^糾正間歇性低氧導(dǎo)致的肺血管內(nèi)皮細(xì)胞功能紊亂，拮抗ET-1等縮血管活性物質(zhì)，促進(jìn)血管舒張因子（NO）等物質(zhì)的釋放，間接舒張肺微動(dòng)脈平滑肌，抑制肺血管重構(gòu)，具體調(diào)控機(jī)制值得進(jìn)一步研究。

間歇性低氧暴露導(dǎo)致肺微動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞功能受損，Ipt具有選擇性調(diào)控低氧暴露狀態(tài)下肺微動(dòng)脈的作用特征；Acz可以顯著改善低氧暴露所致的內(nèi)皮細(xì)胞功能異常，但并不影響Ipt對(duì)低氧暴露肺微動(dòng)脈的選擇性擴(kuò)張作用。因此，Ipt具有發(fā)展為新型肺動(dòng)脈高壓治療藥物的潛力。

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