王慧云

（濟(jì)寧醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院，山東日照276826）

由于人體病理組織如炎癥或感染區(qū)域，某些腫瘤組織或局部缺血時會出現(xiàn)異常酸化現(xiàn)象，從而導(dǎo)致了其pH值較正常組織的pH偏低[1－4]?；诖松硖攸c(diǎn)pH敏感藥物傳遞系統(tǒng)應(yīng)運(yùn)而生，它可以通過環(huán)境pH值的變化，實(shí)現(xiàn)藥物的控制釋放，或者根據(jù)病變部位與機(jī)體正常生理狀態(tài)pH值差別而實(shí)現(xiàn)靶向給藥[5]，減少藥物的不良反應(yīng)[6－7]，其研究和應(yīng)用近年來受到了國內(nèi)外的廣泛關(guān)注[8－9]。其中pH敏感類脂囊泡由于其具有較pH敏感脂質(zhì)體更高的穩(wěn)定性而成為新型藥物傳遞系統(tǒng)領(lǐng)域的一大亮點(diǎn)[10]。pH敏感類脂囊泡的制備通常由非離子表面活性劑與膽固醇及pH敏感物質(zhì)共同組成[11－16]。非離子Gemini由2個親水基和2個疏水基構(gòu)成的一類新型表面活性劑，具有高表面活性、生物安全性及傳統(tǒng)表面活性劑良好的協(xié)同作用等特點(diǎn)[17－18]。然而關(guān)于非離子Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質(zhì)及pH敏感性和穩(wěn)定性的影響較少報道。本文利用Gemini表面活性劑與Tween 20膽固醇、膽固醇半琥珀酸酯為囊材制備了pH敏感類脂囊泡，考察了Gemini表面活性劑對囊泡穩(wěn)定性及pH敏感性的影響，旨在開發(fā)新型pH敏感藥物傳遞系統(tǒng)及拓寬Gemini表面活性劑的應(yīng)用領(lǐng)域。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 儀器與藥品

1.1.1 儀器 JY92－Ⅱ超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)（寧波新芝生物科技股份有限公司）；2X－2型旋片式真空泵（南京市真空泵廠）；8010型攪拌式超濾杯（MILLIPORE COMPANY）；RE－52AA渦旋混合器（上海亞榮生化儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；循環(huán)水真空泵（鄭州市長城科工貿(mào)有限公司）；Zetasizer Nano ZS90（英國，Malvern）；F－4600熒光分光光度計(jì)（Hitachi High－Technolodies Corporation Tokyo Japa）；LC－10AT高效液相色譜儀（日本島津株式會社）；N－2000雙通道色譜工作站（浙江大學(xué)智能信息程研究所有限公司）；ZRS－8G智能溶出試驗(yàn)儀（天津大學(xué)無線電廠）。

1.1.2 藥品 吐溫20（上海山浦化工有限公司）；2，4，7，9－tetramethyl－5－decyne－4，7－diol ethoxylate（Gemini表面活性劑）（Sigma－Aldrich）；膽固醇半琥珀酸酯（CHEMS）（Sigma）；膽固醇（CHOL）（AR，上海藍(lán)季科技發(fā)展有限公司）；8－羥基－1，3，6－芘三磺酸三鈉（HPTS）（sigma）；胎牛血清（上海勁馬生物科技有限公司）；三氯甲烷（AR，江蘇南京中山集團(tuán)公司化工廠）；甲醇（AR，江蘇南京中山集團(tuán)公司化工廠）；醋酸緩沖溶液（pH 5.4，北京百匯生物科技有限責(zé)任公司）；磷酸鹽緩沖溶液（pH 7.4，LR，北京索寶生物科技有限公司）。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 pH敏感類脂囊泡的制備與純化 采用薄膜水化—超聲法制備制備pH敏感類脂囊泡，取適量的表面活性劑Tween20、Gemini與膽固醇以及pH敏感物質(zhì)膽甾醇半琥珀酸酯按照一定的配比溶于氯仿和甲醇的混合液中，使其溶解，利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀于適當(dāng)溫度下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)成膜，然后加入含有熒光探針HPTS的緩沖溶液水化，將得到的混懸液于常溫水浴中超聲處理5min（超聲功率400 W，間隔3s，工作3s），即得到pH敏感型HPTS囊泡混懸液。囊泡的純化：應(yīng)用美國MILLIPORE公司的攪拌式超濾杯，加入囊泡混懸液后，向容器內(nèi)通入氮?dú)馓岣叱瑸V壓力，同時開啟磁力攪拌，游離藥物和溶劑分子被擠壓排出超濾膜外。

1.2.2 囊泡粒度和zeta電位的測定 利用動態(tài)光散射（DLS）測定囊泡大小及電位：將囊泡混懸液超聲處理后，用緩沖溶液稀釋，再經(jīng)微孔濾膜過濾后，放入Zetasizer Nano ZS 90納米粒度zeta電位分析儀樣品池中，于25℃，散射角為90.0°條件下測定囊泡大小及分散指數(shù)。將樣品放入U型樣品池中測其zeta電位。

1.2.3 囊泡包封率的測定 將載藥囊泡用磷酸鹽緩沖液水化，超聲混勻，立即倒入超濾杯進(jìn)行超濾，取出濾液，用HPLC進(jìn)行測量，此濃度為C剩余，即未包入囊泡的游離藥物，求出樣品中未包入囊泡的藥物的質(zhì)量D剩余，再求出藥品中投入藥物總量D總，代入下式即可求出包封率。

高效液相參數(shù)：色譜柱為C18色譜柱（250mm ×4.6mm，5μm）。流動相為甲醇和磷酸鹽緩沖液，二者體積比為50∶50，超聲0.5h脫氣。紫外檢測波長246nm，流速1.0ml／min。進(jìn)樣量20μl，柱溫為室溫。

1.2.4 囊泡形態(tài)的測定 取囊泡混懸液少許滴于載玻片上，加蓋玻片，加1滴香柏油，于光學(xué)顯微鏡下觀察，接數(shù)碼相機(jī)拍照。囊泡在顯微鏡下的形態(tài)如圖1所示。

圖1 囊泡的光學(xué)顯微鏡照片（×4000）

由圖1可見，所制得的類脂囊泡為球形，具有明顯的雙層膜結(jié)構(gòu)。

1.2.5 類脂囊泡體外pH敏感性的考察 載藥囊泡在不同pH環(huán)境中釋放速率：將超濾后的囊泡放入透析袋中，然后放入裝有250ml pH7.4或pH5.4的緩沖溶液的智能溶出儀燒杯中，透析袋置于攪拌漿的下端，設(shè)定溫度為37℃，轉(zhuǎn)速為50 r／min，模擬體內(nèi)環(huán)境進(jìn)行藥物緩釋性實(shí)驗(yàn)。于1～8h每小時取樣1次，吸取釋放液5ml，同時補(bǔ)充5ml緩沖溶液。釋放液用高效液相色譜法檢測峰面積，從而求得HPTS的累積釋放度。

血清對類脂囊泡穩(wěn)定性和pH敏感性的影響：將適量pH敏感類脂囊泡混懸液加入含有50%胎牛血清的緩沖溶液中，培育2h后用pH＝7.4的PBS緩沖溶液和pH＝5.4的醋酸緩沖溶液稀釋100倍，然后利用F－4600熒光分光光度計(jì)測定其熒光強(qiáng)度，溫度25℃、發(fā)射波長為510nm，用2.5nm的狹縫寬度，在300～600nm范圍內(nèi)以10nm／min的速度掃描，掃面出最大激發(fā)波長后，再固定激發(fā)波長。通過測定不同pH下囊泡的熒光強(qiáng)度及包載物質(zhì)的累積釋放量來考察囊泡的pH敏感性。

1.3 各因素對類脂囊泡的影響

1.3.1 CHEMS對類脂囊泡理化性質(zhì)及包封率的影響 文獻(xiàn)[19]報道，在非離子表面活性劑囊泡的制備中加入CHEMS可改變膜的流動性，該功能與加入膽固醇相似，因此在實(shí)驗(yàn)中保持膽固醇和CHEMS的總量不變，但改變膽固醇和CHEMS的比例，考察不同pH下CHEMS對囊泡理化性質(zhì)及包封率的影響。Tween 20∶Gemini∶（CHOL＋CHEMS）為0.5∶0.5∶1.

1.3.2 Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質(zhì)及包封率的影響 固定Tween 20、膽固醇、CHEMS的量（分別為100nmol、50nmol、50nmol），考察不同Gemini表面活性劑的量分別（0nmol、20nmol、40nmol、60nmol、80nmol、100nmol、150nmol）對囊泡理化性質(zhì)及包封率的影響。

1.3.3 Gemini表面活性劑對類脂囊泡pH敏感性的影響 篩選出一定配比的囊泡體系，分別考察不同pH下含有及不含Gemini表面活性劑的囊泡體系所包載物質(zhì)的釋放行為及粒度變化，并進(jìn)一步考察胎牛血清蛋白對該類囊泡體系穩(wěn)定性及pH敏感性的影響。

2 結(jié)果與討論

2.1 CHEMS對類脂囊泡理化性質(zhì)及包封率的影響

CHEMS對類脂囊泡粒度、分布指數(shù)、電位及包封率的影響，結(jié)果見表1。

表1 不同pH條件下CHEMS對囊泡粒度、zeta電位、PDI的影響

由表1可見，修飾有CHEMS的囊泡粒度大小及表面電荷明顯收到pH的影響，但在相同pH條件下，隨CHEMS量的增加粒度變化并不顯著，但電位明顯隨CHEMS的增加而增加。相同CHEMS含量條件下，囊泡的粒徑隨pH的降低而增加，電位隨pH降低顯著減小，PDI也隨pH的降低而增加，說明加入CHEMS后囊泡在較低pH條件下穩(wěn)定性降低。這是由于CHEMS是一種pH敏感分子，當(dāng)處于酸性環(huán)境中時，由于CHEMS的極性頭基發(fā)生質(zhì)子化或水化，從而降低了zeta電位及脂質(zhì)膜的穩(wěn)定性，膜失穩(wěn)后可能導(dǎo)致兩親性分子的重組，電位的降低將導(dǎo)致囊泡的聚集，從而使得其粒度及分布系數(shù)有較大變化。

2.2 Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質(zhì)及包封率的影響

Gemini表面活性劑對類脂囊泡理化性質(zhì)及包封率的影響結(jié)果見表2。

表2 Gemini表面活性劑對pH敏感類脂囊泡粒度、PDI、電位及包封率的影響

由表2可見，隨Gemini表面活性劑用量的增加，體系粒度值略有增加，zeta電位并沒有發(fā)生明顯變化，但PDI值變化較明顯，隨Gemini表面活性劑用量的增加PDI總體變化趨勢是先降低后增加，體系的包封率也隨著Gemini表面活性劑用量的增加而增加，但增加到一定值后基本不再發(fā)生明顯變化，甚至略有降低。

出現(xiàn)這些現(xiàn)象的原因可能是，這可能是由于非離子Gemini表面活性劑具2個親水基和2個疏水基，有較強(qiáng)的表面活性，分散能力較傳統(tǒng)表面活性劑強(qiáng)，且連接基團(tuán)插入囊泡雙層膜中進(jìn)一步增加了膜的穩(wěn)定性，從而增加了其包封率及粒度分布的均勻性。當(dāng)濃度過高時，由于Gemini表面活性劑的強(qiáng)分散能力，使其與Tween 20及膽固醇／膽甾醇半琥珀酸酯之間的協(xié)同成膜能力降低，包封率隨Gemini表面活性劑濃度的增加反而降低。

2.3 Gemini表面活性劑對類脂囊泡pH敏感性的影響

選擇處方為Tween20 50nmol、膽固醇50nmol CHEMS 50nmol、Gemini 50nmol囊泡體系，分別將其放入pH7.4的磷酸鹽緩沖溶液及pH5.4的醋酸緩沖溶液中，測定HPTS在不同pH條件下的累積釋放曲線。結(jié)果見圖2。

圖2 類脂囊泡體系在不同pH條件下的釋藥行為

由圖2可見：2種pH敏感類脂囊泡在較低pH條件下藥物快速釋放，而不含CHEMS的類脂囊泡，HPTS釋放較慢，對藥物具有一定緩釋作用。含有Gemini表面活性劑的類脂囊泡其釋放速率在2種pH條件下均較不含Gemini體系略低，可能是由于在實(shí)驗(yàn)條件下，Gemini表面活性劑與處方中其他處分間產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)，從而使得類脂囊泡的膜更緊密，從而導(dǎo)致了其釋放速率減小，但從圖中可見，Gemini表面活性劑的存在對類脂囊泡的pH敏感度影響不大。

胎牛血清對含Gemini表面活性劑pH敏感類脂囊泡穩(wěn)定性及pH敏感度的影響結(jié)果見圖3。

圖3 pH敏感類脂囊泡在不同pH值下的熒光強(qiáng)度與隨pH值的變化

由圖3可見，經(jīng)過胎牛血清培育2h后，pH敏感類脂囊泡在較低pH下，熒光強(qiáng)度顯著降低，說明體系仍具有較好的pH敏感性。相對來說，含有Gemini表面活性劑的pH敏感類脂囊泡，經(jīng)過牛血清培育后其pH敏感程度相對不含Gemini體系來說略有降低，但影響不是太大?？赡苁怯捎贕emini表面活性劑與處方中其他成分存在較強(qiáng)的協(xié)同效應(yīng)，構(gòu)成的雙層膜的穩(wěn)定性較強(qiáng)，從而使得熒光物質(zhì)不宜泄漏，故其在較低pH條件下，囊泡的熒光強(qiáng)度高于pH敏感非離子表面活性劑囊泡體系。

3 結(jié)論

Tween 20表面活性劑與2，4，7，9－tetramethyl－5－decyne－4，7－diol ethoxylate（Gemini表面活性劑）、膽固醇、膽固醇半琥珀酸酯可形成粒度大小合適、分布均勻、包封率高、pH敏感性強(qiáng)的類脂囊泡，CHEMS的加入，對囊泡的粒度沒有明顯影響，但卻可顯著增加其zeta電位和pH敏感性。Gemini可增加pH敏感類脂囊泡的均勻度及包封率，對其pH敏感性影響不大，因此pH敏感Gemini類脂囊泡將成為一種非常有潛力的靶向藥物傳遞系統(tǒng)。

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