中國人民解放軍后勤學(xué)院門診部（100858）李敏

血小板的聚集（platelet aggregation）是指血小板與血小板之間的相互粘著，這一過程需要纖維蛋白原、Ca2+及血小板膜上的GPIIb/IIIa的參與。在未受刺激的靜息血小板膜上的GPIIb/IIIa并不能與纖維蛋白原結(jié)合。在致聚劑的激活下，GPIIb/IIIa分子上的纖維蛋白原受體暴露，在Ca2+的作用下纖維蛋白原可與之結(jié)合，從而連接相鄰的血小板，充當(dāng)聚集的橋梁，使血小板聚集成團(tuán)。

血小板聚集反應(yīng)的形式可因致聚劑的種類及濃度的不同而有差異。如低濃度ADP引起的血小板聚集只出現(xiàn)在第一聚集時相，并很快解聚；中等濃度ADP引起的聚集，在第一時相結(jié)束和解聚后不久，又出現(xiàn)不可逆的第二聚集時相，第二聚集時相的出現(xiàn)是由于血小板釋放內(nèi)源性ADP所致；高濃度ADP引起的聚集，由于第一聚集時相和第二聚集時相相繼發(fā)生，只出現(xiàn)單一的不可逆性聚集。凝血酶所引起的血小板聚集反應(yīng)與ADP相似，也呈劑量依賴方式，引起單相或雙向血小板聚集。膠原只引起血小板單相的不可逆聚集，聚集反應(yīng)與釋放反應(yīng)同時發(fā)生，故膠原所誘發(fā)的血小板單相聚集與內(nèi)源性ADP的釋放和TXA2的形成有關(guān)[1]。

目前，從血小板發(fā)生聚集作用的機制來看，抗血小板聚集藥物主要有：①抑制血栓烷A2（thromboxane A2，TXA2）誘導(dǎo)的血小板聚集，以阿司匹林（aspirin）為代表；②抑制二磷酸腺苷（adenosine diphosphate，ADP）誘導(dǎo)的血小板聚集，以噻氯匹啶（tic1opidine）、氯吡格雷（clopidogrel）為代表；③血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體拮抗藥，抑制血小板聚集的最終共同途徑，代表藥物為阿昔單抗（abciximab）、替羅非班（tirofiban）、依替巴肽（eptifibatide）。此外，血小板激活因子（PAF）受體拮抗劑、凝血酶和凝血因子Xa（FXa）抑制劑、鈣離子（Ca2+）通道拮抗劑、5-HT2受體拮抗劑等均有抑制血小板聚集作用，本文依次僅從以上3個方面對抗血小板藥物進(jìn)行綜述，并簡述一些重要的抗血小板活性。

1 血栓烷A2（TXA2）抑制劑

1.1 阿司匹林（ASA） 阿司匹林是最早被應(yīng)用于抗栓治療的抗血小板藥物，主要用于無ASA過敏或未接受溶栓、抗凝治療的心、腦血管動脈血栓疾病的一、二級預(yù)防。ASA的一級預(yù)防療效由迄今最大的一項Meta分析再次予以肯定[2]，ASA已經(jīng)被確立為治療急性心肌梗死（AMI）、不穩(wěn)定心絞痛及心肌梗死（MI）二級預(yù)防的經(jīng)典用藥。ASA在體內(nèi)具有抗血栓的特性，能明顯減少周圍動脈內(nèi)阻塞性血栓的形成。

1971年，Vane闡明了低濃度阿司匹林的主要作用機制是不可逆阻斷乙?；h(huán)氧酶（COX2）活性部分，從而阻斷TXA2生成的作用，而后者是血小板聚集的一個強力促進(jìn)因素。高濃度阿司匹林能直接抑制血管壁中合成酶，減少前列環(huán)素的合成，不利于對TXA2作用的對抗和平衡，而且發(fā)生明顯的胃腸道不良反應(yīng)。因此，使用阿司匹林應(yīng)選擇合適的劑量，阿司匹林經(jīng)腸胃吸收后30～40min可達(dá)峰值，當(dāng)給予低于160mg的口服劑量在30min可最大程度抑制血小板功能，大多數(shù)人每天只要服用80～100mg的阿司匹林，即可較好地防止動脈血栓形成。在我國，阿司匹林用于腦卒中二級預(yù)防推薦劑量為50～100mg/d[3]，而用于預(yù)防急性心肌梗死或冠心病介入治療手術(shù)后，應(yīng)每日1次口服300mg[4]。

1.2 魚油制劑 花生四烯酸（AA）是膜磷脂的正常組成部分，為血栓烷（TXA2）生物合成的前體，經(jīng)環(huán)氧化酶途徑生成不穩(wěn)定的環(huán)內(nèi)過氧化物，再經(jīng)血小板內(nèi)血栓烷合成酶作用生成TXA2。魚油制劑的主要成分是二十碳五烯酸（EPA）和二十二碳六烯酸（DHA）。動物實驗表明，于動脈腔內(nèi)成形術(shù)前3周開始應(yīng)用魚油制劑可降低動脈腔內(nèi)成形術(shù)時及術(shù)后血小板的黏附功能，增加血小板膜的流動性，這有助于減輕手術(shù)局部血小板與血管壁的相互作用，防止早期血栓形成及晚期中膜平滑肌細(xì)胞的增殖。

2 磷酸二酯酶（ADP）抑制劑

血小板內(nèi)的ATP在腺苷酸環(huán)化酶的催化下生成cAMP，cAMP在磷酸二酯酶的作用下代謝成5′-2AMP，cAMP通過cAMP依賴蛋白激酶調(diào)節(jié)血小板功能。血小板聚集本質(zhì)上是一個Ca2+的纖維蛋白原橋連過程，血小板聚集功能受到血小板內(nèi)的cAMP含量調(diào)節(jié)，當(dāng)cAMP含量增加，可以激活蛋白激酶，使蛋白磷酸化，興奮鈣泵并抑制Ca2+從儲庫中釋放，從而抑制血小板的聚集；因此腺苷酸環(huán)化酶激活劑和血小板磷酸二酯酶抑制劑均可增加血小板內(nèi)cAMP含量，抑制血小板聚集[5]。

2.1 磷酸二酯酶抑制劑

2.1.1 雙嘧達(dá)莫（dipyridamole） 又名潘生?。╬ersantin），1960年始用于臨床作為血管舒張劑，隨后體外實驗發(fā)現(xiàn)雙嘧達(dá)莫可以抑制心血管患者血小板聚集，對血小板有抑制作用，因此逐漸被應(yīng)用作為抗血小板藥物。其主要的作用機制是抑制磷酸二酯酶，使cAMP增高，也能抑制紅細(xì)胞和血管內(nèi)皮對腺苷的攝取和代謝，進(jìn)而激活血小板腺苷環(huán)化酶使cAMP濃度增高，還可以刺激前列腺素的釋放以及抑制TXA2的形成。該類藥物的缺點是化學(xué)穩(wěn)定性差，半衰期短，必須加倍劑量或者使用緩釋劑才能在24h內(nèi)起到抑制血小板功能的作用。臨床應(yīng)用發(fā)現(xiàn)其在抗冠狀動脈血栓形成、腦卒中復(fù)發(fā)方面有重要作用。在經(jīng)皮冠狀動脈介入治療術(shù)后患者的抗血小板治療中，聯(lián)合應(yīng)用雙嘧達(dá)莫和氯吡格雷，可降低近期死亡率且不增加腦出血等副作用。

2.1.2 西洛他唑[6]西洛他唑是喹啉類衍生物，通過抑制細(xì)胞的磷酸二酯酶（特別是對PDEⅢ的抑制）來治療間歇性跛行。西洛他唑及其代謝產(chǎn)物是cAMP2PDEⅢ抑制劑，抑制活性和阻礙cAMP降解（和轉(zhuǎn)化）導(dǎo)致cAMP在血小板和血管內(nèi)上升，抑制了血小板聚集和使血小板擴(kuò)張，防止血栓形成和血管阻塞，從而達(dá)到治療目的。西洛他唑在治療老年血栓性疾病患者血小板聚集上優(yōu)于噻氯匹啶并且副作用小，治療糖尿病下肢血管病變的疼痛和間性跛行癥狀療效明顯優(yōu)于雙嘧達(dá)莫。

2.2 ADP受體拮抗劑 ADP是第一個被發(fā)現(xiàn)可以促進(jìn)血小板聚集的分子[7]，它存在于血小板致密顆粒上，在血小板激活時被釋放并進(jìn)一步激活周圍循環(huán)中的血小板加速聚集[8]，是血小板聚集的重要活性因子之一。ADP在血小板質(zhì)膜上存在3種受體：P2Y1、P2Y12和P2X1。

P2X1是鈣離子通道受體[9]，研究表明，P2X1受體對血小板聚集作用很小。P2Y1和P2Y12則是兩種不同的G蛋白偶聯(lián)受體。P2Y1受體與G蛋白偶聯(lián)，激活后誘導(dǎo)血小板變形和快速、可逆性聚集[10]。

2.2.1 噻氯吡啶 噻氯吡啶是一強效的血小板抑制劑，主要通過與ADP受體P2Y12發(fā)生不可逆結(jié)合而競爭性抑制ADP所誘導(dǎo)的血小板聚集，還可以抑制由花生四烯酸（AA）、膠原、血小板活化因子（PAF）等所引起的血小板聚集和釋放，其最終作用是干擾血小板糖蛋白Ⅱb/Ⅲa受體與纖維蛋白原結(jié)合，從而抑制血小板的激活。噻氯吡啶口服吸收良好，24～48h發(fā)揮作用，3～5d達(dá)高峰，t1/2為24～33h。用于預(yù)防急性心肌再梗死、一過性腦缺血及中風(fēng)、治療間歇性跛行等[11]。

2.2.2 氯吡格雷 氯吡格雷是第二代ADP受體拮抗劑，是一種無活性的藥物前體，進(jìn)入體內(nèi)經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450混合功能氧化酶（CYP450酶）系（主要是CYP3A4、CYP3A5）氧化成為有活性的代謝產(chǎn)物，該活性產(chǎn)物有一個活化巰基基團(tuán)，可與P2Y12（ADP的受體）的半胱氨酸殘基形成二硫鍵，不可逆地阻斷ADP與其受體的結(jié)合，進(jìn)而阻斷ADP激活血小板聚集的整個過程，抑制血小板聚集[12]。每日1次口服75mg，在腸道迅速吸收，從第1d開始明顯抑制ADP誘導(dǎo)的血小板聚集，抑制作用逐漸增強并在3～7d達(dá)到穩(wěn)態(tài)。一般中止治療5d內(nèi)血小板聚集和出血時間逐漸回到基線水平。

3 糖蛋白Ⅱb/Ⅲa（GPⅡb/Ⅲa）受體拮抗劑

血小板GPⅡb/Ⅲa是一種膜結(jié)合蛋白，在靜息血小板表面約有8萬個分子。它是纖維蛋白原受體，由α和β兩個亞單位組成的異二聚體，每個亞單位都有胞外區(qū)、跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)。在激活劑作用下，血小板活化并導(dǎo)致GPⅡb/Ⅲa受體的空間構(gòu)象發(fā)生變化，以便與纖維蛋白原或Von Wllebrand因子等結(jié)合，從而誘導(dǎo)血小板發(fā)生聚集。血小板GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑結(jié)合到受體上，使其不能與黏附蛋白結(jié)合，從而抑制了血小板的聚集，但并不消除血小板的黏附和分泌等重要功能。

由于GPⅡb/Ⅲa與纖維蛋白原的結(jié)合是血小板聚集的終末共同途徑，因而血小板GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑可有效地預(yù)防血小板介導(dǎo)的血栓形成。目前，已獲美國FDA批準(zhǔn)的主要有3種經(jīng)靜脈的血小板GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，即阿昔單抗、依替巴肽和替羅非班。

GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑的化學(xué)類型不盡相同，在抗血小板效力上也存在差異，這也許就是它們在減少患者血栓缺血事件上療效不同的原因之一[13]。阿昔單抗是血小板GPⅡb/Ⅲa受體的人與鼠嵌合單克隆抗體（C7E3），可以與GPⅡb/Ⅲa受體非特異性結(jié)合，使纖維蛋白原不能與GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，從而發(fā)揮抑制血小板聚集的作用。依替巴肽是肽類GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，通過與血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受體結(jié)合，占據(jù)其結(jié)合位點，使血小板膜上GPⅡb/Ⅲa受體與纖維蛋白原不能結(jié)合而抑制血小板的聚集。依替巴肽對血小板糖蛋白上Ⅱb/Ⅲa受體的抑制作用是競爭性抑制，濃度越高時抑制作用越強。依替巴肽與Ⅱb/Ⅲa受體的結(jié)合是可逆性的，停藥后4h依替巴肽的作用減弱一半。替羅非班（tirofiban）是非肽類GPⅡb/Ⅲa受體拮抗劑，不具有抗原性，可以與GPⅡb/Ⅲa受體可逆性結(jié)合，選擇性抑制GPⅡb/Ⅲa，進(jìn)一步阻斷纖維蛋白原與GPⅡb/Ⅲa結(jié)合，抑制血小板聚集。

4 通過酶切血小板膜糖蛋白GPIb

從中華眼鏡蛇毒中分離純化出一個新的金屬蛋白酶atrase A，Atrase對ristocetin和thrombin誘導(dǎo)的血小板聚集有明顯的抑制作用，這種抑制作用可能是與血小板膜糖蛋白GPIb和vWF關(guān)系密切，Western blot結(jié)果也證實了atrase A能特異性酶切血小板膜糖蛋白GPIb，而對vWF沒有表現(xiàn)出裂解作用。在實驗中筆者還發(fā)現(xiàn)，atrase A對ristocetin誘導(dǎo)的人PRP血小板聚集有明顯的抑制作用，但對兔PRP誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用則不明顯，且ristocetin誘導(dǎo)兔血小板的聚集率明顯低于其他5種誘導(dǎo)劑。Atrase A對thrombin誘導(dǎo)的兔血小板聚集有明顯的抑制作用，對人PRP的抑制作用不明顯，造成這些差別的原因和機制尚不清楚，可能與實驗材料的種屬差異性有關(guān)，有待于進(jìn)一步深入研究。

實驗結(jié)果還顯示，與血小板預(yù)孵5min時，atraseA對ADP、PAF、AA、collagen引起的血小板聚集有微弱的抑制作用。隨著預(yù)孵時間延長至30min，atrase A對ADP、PAF、AA、collagen引起的血小板聚集有明顯的抑制作用。由于上述4種誘導(dǎo)劑引起血小板聚集的機制不一樣，并有文獻(xiàn)報道[14]蛇毒金屬蛋白酶抑制上述4種誘導(dǎo)劑引起血小板聚集的機制也不相同，而已分離純化出的atrase A是多結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶，它抑制上述4種誘導(dǎo)劑引起血小板聚集的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)可能與其金屬蛋白酶活性結(jié)構(gòu)域有關(guān)，也可能與其去整合素和類去整合素樣結(jié)構(gòu)以及富含半胱氨酸結(jié)構(gòu)有密切關(guān)系，因此它抑制4種誘導(dǎo)劑引起血小板聚集的具體作用機制還有待于進(jìn)一步研究。

血小板的主要生理功能是參與止血與血栓形成，并且在動脈粥樣硬化、腫瘤轉(zhuǎn)移和炎癥反應(yīng)等病理損傷過程中起著重要的作用。由于蛇毒中的一些金屬蛋白酶能廣泛影響血液凝固、血小板聚集以及血栓的形成，因此充分利用蛇毒資源開發(fā)抗血栓藥已經(jīng)成為研究的熱點。本實驗發(fā)現(xiàn)，從中華眼鏡蛇毒中分離純化出的金屬蛋白酶atrase A，通過特異性酶切血小板膜糖蛋白GPIb從而抑制ristocetin和thrombin誘導(dǎo)的血小板聚集，并對ADP、PAF、AA、collagen誘導(dǎo)的血小板聚集的抑制作用具有明顯的時間依賴性。Atrase A是否在體內(nèi)具有抗凝活性以及能否作為一種潛在的抗血栓藥物尚需要進(jìn)一步的研究和評價。

5 細(xì)胞質(zhì)鈣活化抑制劑和MAPK蛋白磷酸化抑制劑（如ERK2或p38MAPK）

鈣離子在血小板聚集中起重要作用，并且能夠被凝血酶、膠原或者ADP內(nèi)源性或者外源性激活細(xì)胞質(zhì)膜上的受體。Ca2+的增加來自于兩種途徑：內(nèi)在的儲存和通過質(zhì)膜鈣通道進(jìn)入。G蛋白偶聯(lián)受體的激活，如凝血酶受體PAR1和PAR3或者P2Y ADP[15][16]受體，均導(dǎo)致磷脂酶-β的激活。

此外，膠原與糖蛋白連結(jié)于血小板，并且提高了PLC的活性，通過磷?；野彼釟埢系腜LCγ-2。因此，兩種類型的受體均能刺激從fromphosphatidylinositol二磷酸中釋放三磷酸肌醇。IP3結(jié)合受體2型IP3分泌顆粒，導(dǎo)致人類的血小板減少，減少鈣的動員[17][18][19]。這種細(xì)胞內(nèi)鈣離子的上調(diào)，刺激下游區(qū)的靶蛋白，包括鈣調(diào)蛋白激酶，肌漿球蛋白輕鏈激酶和蛋白激酶C。由于這個原因，筆者認(rèn)為，在膠原活化的血小板中，davallialactone的抗血小板活性是由于對鈣動員的抑制。

MAPKs包括ERK、p38MAPK和JNK在血小板中可被許多激活劑激活，如膠原和凝血酶[18][19][20][21]。雖然在血小板激活過程中，ERK和p38MAPK所起的作用仍有爭議[22][23]。SB203580、p38MAPK特異性抑制劑，能夠抑制由膠原或凝血酶誘導(dǎo)的血小板的活化[24]，研究表明，ERKs在膠原和凝血酶刺激下被激活[25]，并且ERKs的激活包含于膠原誘導(dǎo)的血小板的聚集和分泌。在人的血小板中，ERK的級聯(lián)反應(yīng)需要激活儲存的Ca2+內(nèi)流。雖然激動劑（包括膠原和凝血酶）可以誘導(dǎo)鈣動員，但結(jié)果顯示，為了使Ca2+濃度達(dá)到使血小板活化的水平，必須有另外的Ca2+內(nèi)流。因此，在膠原誘導(dǎo)的血小板聚集中，davallia-lactone對ERK2和p38MAPK磷酸化的抑制作用似乎對此物的抗血小板活性有部分作用，細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)激酶1和2均能在血小板中出現(xiàn)。筆者發(fā)現(xiàn)，ERK2可被膠原和凝血酶刺激而激活。

6 結(jié)語

綜上所述，由于血小板在不同疾病、不同病人和不同疾病階段中所起的作用不同，且影響血小板聚集的因素很多，因此應(yīng)通過實驗研究、病理檢查、不斷開發(fā)具有新適應(yīng)癥的抗血小板聚集藥物，從分子生物學(xué)角度對血小板與血栓性疾病機制進(jìn)行更為深入的研究，將有助于發(fā)現(xiàn)新的作用靶點，為研究開發(fā)新型的抗血小板藥物提供更大的發(fā)展空間。多種重要有效成分具有顯著抗血小板聚集作用，但對其作用機制的闡釋尚需要深入。