張 蕾，常 宏，徐 東

（1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院心臟中心，北京100053；2.河北醫(yī)科大學基礎課教學部生物化學教研室，河北石家莊050091）

·論 著·

小G蛋白Rab40a的亞細胞定位及功能研究

張 蕾1，常 宏2*，徐 東1

（1.首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院心臟中心，北京100053；2.河北醫(yī)科大學基礎課教學部生物化學教研室，河北石家莊050091）

目的研究小G蛋白Rab40a的亞細胞定位及參與的細胞內(nèi)囊泡運輸路徑。方法應用共聚焦顯微鏡技術，研究綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）標記的Rab40a在Hela細胞內(nèi)與各種亞細胞結(jié)構(gòu)，特別是轉(zhuǎn)運囊泡的共定位。利用RNA沉默技術研究Rab40a可能參與的細胞內(nèi)囊泡轉(zhuǎn)運過程。結(jié)果Rab40a與高爾基標記蛋白Golgin-97、內(nèi)吞體標記蛋白EEA1存在共定位；干擾Rab40a表達明顯阻斷了霍亂毒素B自內(nèi)吞體向高爾基體的轉(zhuǎn)運。結(jié)論Rab40a定位于細胞內(nèi)吞體和高爾基體，參與細胞內(nèi)內(nèi)吞體到高爾基體之間的轉(zhuǎn)運。

GTP結(jié)合蛋白類；脂質(zhì)體；RNA干擾

真核細胞各細胞器之間通過囊泡運輸和微管系統(tǒng)進行物質(zhì)的交換和信息傳遞，從而調(diào)節(jié)細胞的生長、發(fā)育、分裂及細胞與細胞間的物質(zhì)交換。小G蛋白，包括Ras、Raf、Arf、Rho和Rab等廣泛參與這一過程。其中最大的亞家族，Rab家族目前已確定的成員超過60個，在囊泡的形成、轉(zhuǎn)運、黏附、錨定和融合等過程中起重要作用［1－3］。在本實驗室另一項關于GPR30的研究中，我們發(fā)現(xiàn)Rab40a與GPR30相互作用。而人Rab40a的功能卻未見報道。為此，我們利用共聚焦顯微鏡和RNA沉默技術，尋找RAB40a可能參與的細胞內(nèi)囊泡運輸路徑。

1 材料與方法

1．1 材料：大腸桿菌JM109購自Promega公司，為河北醫(yī)科大學基礎課教學部生物化學研究室保存。DNA重組所用限制性內(nèi)切酶，T4DNA連接酶，PCR相關試劑，膠回收試劑盒及質(zhì)粒提取試劑盒均購自TAKARA公司。細胞培養(yǎng)用DMEM培養(yǎng)基及胎牛血清，轉(zhuǎn)染試劑lipofectamine 2000購自Invitrogen。引物合成及測序由華大基因公司完成。兔抗GFP多克隆抗體，鼠抗人EEA1，Rab5，Rab11單克隆抗體購自Santa Cruz公司。鼠抗人Golgin-97單克隆抗體，HRP-羊抗兔抗體，Alexa594-羊抗鼠抗體，Mitotracker，Lysotracker購自Invitrogen。

1．2 方法

1．2．1 GFP-Rab40a重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：根據(jù)Rab40a（NM-080879）編碼序列合成上下游引物并引入合適的酶切位點和保護堿基，引物為Rab40a-F（5′-CGGAATTCGATGTGAGCGCCCCGGGCAGC-3′）和Rab40a-R（5′-CGGGATCCTTAAGAAATTTTGCAGCT-3′），下劃線處分別為EcoRI和BamHI酶切位點。PCR擴增Rab40a全長，PCR產(chǎn)物經(jīng)回收與eGFP-C1載體同時用EcoRI與BamHI雙酶切，酶切產(chǎn)物回收后以T4DNA連接酶連接，重組質(zhì)粒GFPRab40a以測序鑒定。

1．2．2 Western Blot檢測：GFP-Rab40a轉(zhuǎn)染的Hela細胞，24h后以去污裂解液裂解細胞。取20μg蛋白上樣進行10％SDS-PAGE電泳。轉(zhuǎn)膜后，封閉（TBS＋5％脫脂奶粉），加一抗GFP（1∶2 000），二抗HRP-羊抗兔抗體（1∶10 000），洗膜后X線片曝光。

1．2．3 細胞培養(yǎng)與質(zhì)粒轉(zhuǎn)染：Hela細胞在放入24孔板的玻片上進行培養(yǎng)達70％～90％融合。在25μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入0.5μg質(zhì)粒，在另一管25μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入lipofectamine 2000 1μL，5min后，將兩管混合置于室溫，20min后加入細胞培養(yǎng)液中。24h后取出玻片，進行免疫熒光染色。

1．2．4 免疫熒光染色：細胞經(jīng)4％多聚甲醛固定15min，PBS洗滌3遍去掉多余的多聚甲醛，加入封閉液（10％馬血清＋PBS）封閉1h，加入一抗室溫1h，PBS洗3遍，然后加入熒光二抗，室溫0.5h，PBS洗3遍后在共聚焦顯微鏡下觀察。

1．2．5 RNA沉默和脈沖追蹤（pulse and chase）：將干擾RNA以無菌水稀釋至終濃度20μmol/L。Hela細胞在放入24孔板的玻片上進行培養(yǎng)達50％～70％融合。在25μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入1μL干擾RNA，在另一管25μL無血清DMEM培養(yǎng)基中加入lipofectamine 2000 2μL，5min后，將兩管混合置于室溫，20min后加入細胞培養(yǎng)液中。24h后細胞分離傳代，再過48h后，加入Alexa 594-標記的霍亂毒素B（5mg/L）或Alexa 594-標記轉(zhuǎn)鐵蛋白（30mg/L），冰上30min，換培養(yǎng)液洗3遍，加入10倍濃度的無標記的霍亂毒素B或轉(zhuǎn)鐵蛋白，37C 30min，取出玻片，進行免疫熒光染色。RNA沉默的效果以RT-PCR進行檢測，引物為Rab40a-F（5′-GGGGATCGACTACAAGACGACC-3′）和Rab40a-R（5′-AGGTGT-GCAGGACACG-3′）。

2 結(jié) 果

2．1 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定：重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI與 BamHI酶切，有約830bp片段插入。測序表明插入片段與Rab40a開放閱讀框序列完全相符，無堿基突變和缺失，插入方向正確，未發(fā)生讀碼框架改變。

2．2 Western Blot檢測GFP-Rab40a在Hela細胞內(nèi)的表達：利用GFP抗體檢測顯示，在轉(zhuǎn)染GFPRab40a的細胞內(nèi)，有一條約50 000條帶，符合預測的融合蛋白相對分子質(zhì)量大小，而未轉(zhuǎn)染的細胞無此條帶。

2．3 GFP-Rab40a的細胞內(nèi)定位：GFP-Rab40a轉(zhuǎn)染的Hela細胞，用多聚甲醛固定，Triton X-100打孔，進行免疫熒光染色。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Rab40a與高爾基標記蛋白Golgin-97、內(nèi)吞體標記蛋白EEA1存在共定位。而其他細胞器標記蛋白（線粒體，溶酶體，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)）不與Rab40a共定位（圖1）。進一步研究發(fā)現(xiàn)，Rab40a與Rab5a、Rab11a存在共定位，提示其功能可能與內(nèi)吞體轉(zhuǎn)運相關（圖2）。

2．4 Rab40a沉默對細胞內(nèi)物質(zhì)運輸?shù)挠绊懀篟TPCR顯示，轉(zhuǎn)染Rab40a干擾RNA的Hela細胞較轉(zhuǎn)染對照無功能小RNA的細胞，Rab40a表達明顯降低。轉(zhuǎn)鐵蛋白的脈沖追蹤（pulse-chase）實驗顯示，干擾Rab40a表達并不對轉(zhuǎn)鐵蛋白在細胞內(nèi)的運輸產(chǎn)生明顯影響。細胞膜上的轉(zhuǎn)鐵蛋白經(jīng)過30min脈沖追蹤，在對照組與Rab40a干擾組，均到達微管組織中心，即循環(huán)內(nèi)吞體集中區(qū)域。而霍亂毒素B的脈沖追蹤實驗表明，干擾Rab40a表達明顯阻斷了霍亂毒素B自內(nèi)吞體向高爾基體的轉(zhuǎn)運，在30min后，干擾組的霍亂毒素B仍散在分布于內(nèi)吞體，而對照組已集中在高爾基體（圖3）。

3 討 論

Rab蛋白家族中，Rab40a的功能尚未見報道。已進行功能研究的Rab家族成員，均特異地參與細胞內(nèi)囊泡運輸?shù)牟煌A段，如Rab1參與新合成蛋白由內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體的轉(zhuǎn)運［4］，而Rab5、Rab4、Rab11組成質(zhì)膜→早期內(nèi)吞體→循環(huán)內(nèi)吞體→質(zhì)膜運輸路徑［5］。在尋找可能與Rab40存在共定位的蛋白過程中，我們首先發(fā)現(xiàn)了早期內(nèi)吞體標記蛋白EEA1，這提示Rab40a參與早期內(nèi)吞體的運輸。但是，早期內(nèi)吞體囊泡內(nèi)的蛋白，會經(jīng)歷不同的命運。一部分會經(jīng)由循環(huán)內(nèi)吞體重新轉(zhuǎn)運到細胞膜上，如轉(zhuǎn)鐵蛋白受體；一部分會演變?yōu)橥砥趦?nèi)吞體→溶酶體，蛋白最終被水解，如生長因子受體；還有一部分會被運送至高爾基體，如霍亂毒素［6－7］。而自高爾基體出芽生成的囊泡，也會被轉(zhuǎn)運至內(nèi)吞體，如CIMPR與CD-MPR［8］。

由于Rab40a與高爾基體蛋白Golgin-97也存在部分共定位，因此我們重點比較了Rab40a對內(nèi)吞體→細胞膜與內(nèi)吞體→高爾基體2種路徑的影響。結(jié)果表明，Rab40a不參與內(nèi)吞體→細胞膜路徑蛋白運輸，而是參與了內(nèi)吞體→高爾基體路徑。有報道Rab11也參與了這一途徑，這與我們發(fā)現(xiàn)Rab40a與Rab11存在共定位相吻合［9］。需要指出的是，Rab40a尚無系統(tǒng)的研究報道，所以商品化的抗體尚未面世。我們目前的研究，是以GFP融合蛋白示蹤Rab40a的細胞內(nèi)分布。這一方法在Rab家族蛋白的研究中被廣泛應用。但亦有報道指出個別Rab蛋白，其內(nèi)源分子與過表達分子的細胞定位存在較大差異［10］。因此，Rab40a抗體的制備，對將來進一步闡明RAab40a的生物學功能至關重要。由于Rab蛋白功能損傷或基因突變會導致很多疾病，如免疫缺陷、癌癥以及神經(jīng)紊亂［11］，故闡明每一個Rab蛋白在細胞內(nèi)確切參與的運輸路徑，對認識這些疾病的病理過程有重要意義。（本文圖見封三）

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（本文編輯：劉斯靜）

SUBCELLAR LOCALIZATION AND FUNCTIONAL STUDY OF SMALL GTPase Rab40a

ZHANG Lei1，CHANG Hong2*，XU Dong1
（1．Department of Cardiology，Xuanwu Hospital of Capital Medical University，Beijing 100053，China；2．Department of Biochemistry，the School of Basic Medical Sciences，Hebei Medical University，Shijiazhuang 050091，China）

Objective To study the subcellular localization and intracellular vesicle transport pathway which small GTPase Rab40a is involved in.MethodsThe colocalization of green fluorescent protein（GFP）labeled Rab40a with subcellular structures，especially transport vesicles in Hela cellswas observed by confocal microscopy.The intracellular vesicular transport pathways which Rab40a may be involved in was studied by using RNA silencing technology.ResultsRab40a was colocalized with endosome and Golgimarker proteins，EEA1 and Golgin-97.Interfering Rab40a blocked the transportation of cholera toxin B from endosome to Golgi.ConclusionRab40a is localized in endosome and Golgi and participates intracellular transport from endosome to Golgi.

GTP-binding proteins；liposomes；RNA interference

R341

A

1007-3205（2013）05-0512-03

2013－02－25；

2013－04－02

張蕾（1974－），女，湖北武漢人，首都醫(yī)科大學宣武醫(yī)院主治醫(yī)師，醫(yī)學碩士，從事影像學及細胞生物學診斷研究。

*通訊作者。E-mail：ch720321＠126.com

10.3969/j.issn.1007-3205.2013.05.006