王 英，綜述;王雪梅，方 強(qiáng)，校審

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌(MTB)引起的一種嚴(yán)重危害人類健康的重要傳染性疾病。根據(jù)WHO 發(fā)布的《2011 年全球結(jié)核病(TB)控制報(bào)告》［1］，患結(jié)核病的人數(shù)降到2010 年的880 萬(wàn)，結(jié)核病死亡數(shù)降到140 萬(wàn)人，結(jié)核病死亡率在1990 年和2010 年之間下降了40%，除非洲之外，其他區(qū)域都可按期實(shí)現(xiàn)到2015 年時(shí)使死亡率降低50%這一目標(biāo);但是流動(dòng)人口劇增、結(jié)核菌與艾滋病毒雙重感染和耐藥結(jié)核菌病的增多均增加了結(jié)核病防治工作的難度，使得結(jié)核病疫情的形勢(shì)依然嚴(yán)峻，防治任務(wù)仍然十分艱巨。在艾滋病感染患者中結(jié)核的發(fā)病率則更高，艾滋病毒攜帶者同時(shí)感染了結(jié)核分枝桿菌后，發(fā)生結(jié)核病的可能性是正常人的34 倍。

卡介苗(BCG)作為目前預(yù)防結(jié)核病唯一獲批使用的一種疫苗，在結(jié)核病預(yù)防中具有舉足輕重的作用，近年來(lái)，已組織BCG 標(biāo)準(zhǔn)化的工作［2］，但許多研究表明，BCG 對(duì)兒童有較好的保護(hù)效果，但預(yù)防成人結(jié)核病的作用仍然有限。近來(lái)的研究不斷證明，BCG 接種可降低兒童的結(jié)核病風(fēng)險(xiǎn)，而且BCG作為一種活疫苗本身存在潛在的致病力，尤其是免疫損傷或缺陷的個(gè)體［3］。所以加快包括滿足HIV 感染個(gè)體需要在內(nèi)的新型疫苗的研發(fā)十分迫切!國(guó)內(nèi)外許多學(xué)者已做了大量的工作，如尋找具有更高保護(hù)效力的結(jié)核桿菌抗原分子、探索更為安全有效的候選抗原分子形式，或通過(guò)不同途徑提高現(xiàn)有疫苗的保護(hù)力。

1 ESAT6 介紹

ESAT6 即6kDa 早期分泌性抗原靶(6kDa early secreted antigenic target)，為ESAT6 家族中的一種，主要存在于結(jié)核桿菌早期培養(yǎng)濾液中，由MTB RD1 區(qū)的ESAT6 基因編碼，含288bp、95 個(gè)氨基酸，理論分子量為9904 Da，用SDS-PAGE 測(cè)得天然ESAT6 的遷移率同6kDa 的多肽相符而得名［4］。Sorensen 等用Western blot、Southern blot 以及PCR 等從基因和蛋白水平分析了ESAT6 的分布，除存在于MTB 培養(yǎng)物濾液中，細(xì)胞漿和細(xì)胞壁中也存在，但不存在于細(xì)胞膜上，而且ESAT6沒(méi)有信號(hào)肽序列，表明其可能是通過(guò)一種非信號(hào)肽形式分泌到細(xì)胞外。ESAT6 僅在致病性分枝桿菌中表達(dá)，其他BCG 亞株和非致病分枝桿菌均不表達(dá)［4］。ESAT6 是結(jié)核病早期調(diào)節(jié)細(xì)胞免疫的重要蛋白，其參與刺激T 細(xì)胞的增殖和誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的凋亡，是抗結(jié)核免疫反應(yīng)的主要配體，有多個(gè)T、B 細(xì)胞及遲發(fā)型超敏反應(yīng)表位，有較強(qiáng)的免疫原性和免疫反應(yīng)性［5］。實(shí)驗(yàn)表明，ESAT6 CD4 +T 淋巴細(xì)胞抗原決定簇能被不同遺傳背景的T 淋巴細(xì)胞識(shí)別，產(chǎn)生大量IFN-γ［6］，而IFN-γ 顯著活化巨噬細(xì)胞，以提高巨噬細(xì)胞對(duì)胞內(nèi)MTB 的抑制作用和殺傷能力［7］。ESAT6 也能誘發(fā)宿主產(chǎn)生特異性CD8 + T 淋巴細(xì)胞，參與抗MTB 感染的免疫反應(yīng)。一些研究表明，RD1 介導(dǎo)的毒力與ESAT6 的分泌有關(guān)，滅活ESAT6 和CFT10 基因，或者分泌系統(tǒng)基因，可使結(jié)核桿菌在巨噬細(xì)胞內(nèi)的生長(zhǎng)減少及感染鼠模型表位的減少［8］。因此，ESAT6 作為一個(gè)有前景的疫苗候選分子在結(jié)核疫苗研究中受到了廣泛的關(guān)注。

2 ESAT6 新型疫苗的類型

根據(jù)疫苗結(jié)構(gòu)的完整性可分為:重組BCG、亞單位疫苗、DNA 疫苗和活載體疫苗等;根據(jù)應(yīng)用方式不同，疫苗又可分為治療性疫苗和預(yù)防性疫苗。治療性疫苗具有治療疾病的作用，是指在已感染結(jié)核分枝桿菌的機(jī)體內(nèi)，通過(guò)疫苗免疫調(diào)動(dòng)宿主的免疫能力，殺傷入侵的結(jié)核分枝桿菌，從而起到治療或輔助化學(xué)藥物治療的作用。而預(yù)防性疫苗是指人們習(xí)慣所說(shuō)的傳統(tǒng)意義上的疫苗，主要起到預(yù)防疾病的作用。結(jié)核疫苗在近幾十年里，有了長(zhǎng)足的進(jìn)展，一部分已經(jīng)進(jìn)入了臨床第一期實(shí)驗(yàn)，還有一部分進(jìn)入了第二期、三期臨床實(shí)驗(yàn)。

2.1 亞單位疫苗 亞單位疫苗是利用致病菌的亞單位，特別是抗原表位，理想的亞單位疫苗應(yīng)該由幾個(gè)保護(hù)性抗原或抗原表位組成。如用MTB 成分作疫苗組份來(lái)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生免疫保護(hù)或免疫治療作用。蛋白質(zhì)多肽疫苗主要考慮抗原和佐劑的選擇，由于單個(gè)抗原的抗原譜窄引起的免疫保護(hù)效率有限，因此將多個(gè)抗原或多肽融合表達(dá)有利于提高疫苗的免疫保護(hù)效果，因重組蛋白的免疫原性較弱，重組蛋白須與佐劑聯(lián)合使用才能滿足亞單位疫苗的要求，近幾年進(jìn)入臨床階段的亞單位疫苗無(wú)不采用了強(qiáng)大的佐劑來(lái)增強(qiáng)疫苗的免疫原性［9］。

Brandt 等［10］將ESAT6 蛋白質(zhì)與佐劑二甲基雙十八烷基溴化銨(DDA)及單磷脂A(MPL)混合皮下注射免疫小鼠3 次后，用結(jié)核桿菌H37Rv 進(jìn)行攻擊，通過(guò)測(cè)定小鼠肝、脾、肺的結(jié)核桿菌荷菌量和IFN－γ 水平，說(shuō)明ESAT6 +DDA+MPL 組的免疫保護(hù)作用達(dá)到了BCG 組的水平，表明ESAT6 可作為抗結(jié)核亞單位疫苗的有效成分。Jes Dietrich 等構(gòu)建了Ag85B －ESAT6 融合蛋白，與佐劑LTK63 聯(lián)合并采用鼻內(nèi)黏膜給藥，發(fā)現(xiàn)分泌IFN-γ 的CD4 細(xì)胞產(chǎn)生強(qiáng)烈的Th1 反應(yīng)，對(duì)MTB 有長(zhǎng)時(shí)間、持續(xù)的保護(hù)力，保護(hù)作用與BCG 相當(dāng)。此外，BCG 初免，Ag85B-ESAT6/LTK63 加強(qiáng)免疫，結(jié)果表明，攻毒后肺部產(chǎn)生的抗結(jié)核病專一性的CD4 T 細(xì)胞明顯高于BCG 組［11］。丹麥國(guó)立血清研究所研制的Ag85B-ESAT6 融合蛋白疫苗，以寡脫氧核苷酸和多陽(yáng)離子氨基酸的混合物(IC31)為佐劑在小鼠和靈長(zhǎng)類動(dòng)物中的免疫保護(hù)力要高于單一的ESAT6 或Ag85B蛋白疫苗，并能增強(qiáng)BCG 的免疫保護(hù)力，目前正在進(jìn)行Ⅱ期臨床試驗(yàn)［12］。

2.2 重組卡介苗 重組卡介苗是將BCG 作為工程菌，將外源基因?qū)隑CG 中，并在宿主內(nèi)復(fù)制，表達(dá)多種外源抗原，以誘導(dǎo)特異性體液免疫和細(xì)胞免疫。目前國(guó)內(nèi)外關(guān)于MTB 分泌蛋白重組卡介苗的研究，主要集中于ESAT6、Ag85B 、38000蛋白、A995A［13］等幾種蛋白上。Demange 等［13］發(fā)現(xiàn)ESAT6 －卡介苗重組疫苗比卡介苗在機(jī)體內(nèi)的存活時(shí)間長(zhǎng)，抗結(jié)核菌的效力更強(qiáng);Pym 等發(fā)現(xiàn)用ESAT6-卡介苗重組疫苗免疫后再用MTB 攻擊，病理改變及病原菌的傳播都較輕，保護(hù)力卻比卡介苗強(qiáng)。張靈霞等重組ESAT6-卡介苗的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也證明了這一結(jié)論。結(jié)核分枝桿菌特異性抗原ESAT6、Ag85A、MPT64、Ag85B 卡介苗重組疫苗的免疫原性實(shí)驗(yàn)表明各卡介苗重組疫苗均能刺激小鼠產(chǎn)生T、B 淋巴細(xì)胞免疫反應(yīng)，而且ESAT6 重組卡介苗組刺激T 淋巴細(xì)胞的能力強(qiáng)于卡介苗，對(duì)結(jié)核桿菌的預(yù)防作用也強(qiáng)于卡介苗［14-15］。目前美國(guó)加利福尼亞大學(xué)洛杉磯分校醫(yī)學(xué)院研制的rBCG30 疫苗，誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)和保護(hù)效率均強(qiáng)于BCG，現(xiàn)已完成Ⅰ期臨床實(shí)驗(yàn)［16］。

2.3 DNA 疫苗 DNA 疫苗是20 世紀(jì)90 年代產(chǎn)生的一種疫苗形式，DNA 疫苗注入機(jī)體后，被肌肉細(xì)胞攝取并進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)，抗原基因在細(xì)胞核內(nèi)被轉(zhuǎn)錄成為mRNA，在細(xì)胞質(zhì)中被翻譯為蛋白質(zhì)，表達(dá)特定的抗原而誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的產(chǎn)生，從而刺激機(jī)體產(chǎn)生體液免疫和細(xì)胞免疫，達(dá)到預(yù)防和治療疾病的目的。過(guò)去的研究發(fā)現(xiàn)DNA 疫苗引起的免疫反應(yīng)屬于TH1型細(xì)胞免疫反應(yīng)的占優(yōu)勢(shì)，它能在機(jī)體內(nèi)誘導(dǎo)T 細(xì)胞產(chǎn)生IFN－γ、激活巨噬細(xì)胞及殺死感染細(xì)胞，產(chǎn)生保護(hù)性免疫反應(yīng)。根據(jù)DNA 疫苗上目的抗原的數(shù)量可以把DNA 疫苗分為單價(jià)、多價(jià)或融合DNA 疫苗。單價(jià)DNA 疫苗誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫應(yīng)答和免疫記憶都不夠理想，通過(guò)佐劑聯(lián)合使用能獲得更加穩(wěn)定、更加持久的免疫效果［17］。多種MTB 抗原的編碼基因可作為DNA 疫苗的主要靶抗原［18］，部分抗原免疫小鼠后用MTB 攻擊證實(shí)可以提供不同程度的保護(hù)［19］。聯(lián)合應(yīng)用相關(guān)的細(xì)胞因子作為佐劑則可以募集并激活專職性抗原遞呈細(xì)胞到局部感染區(qū)，進(jìn)而有效地遞呈抗原，激起抗原特異性T 細(xì)胞免疫應(yīng)答，以抵抗細(xì)菌的感染。根據(jù)免疫方式的不同，又可分為單次免疫和基礎(chǔ)－加強(qiáng)免疫。此外，DNA 疫苗還具有一定的免疫治療作用。

王慶敏等［20］證明ESAT6 DNA 疫苗能在小鼠體內(nèi)誘導(dǎo)特異性免疫反應(yīng)，尤其可誘導(dǎo)較強(qiáng)的T 細(xì)胞反應(yīng)和分泌高水平的IFN-γ。Steven C Derrick 等［21］發(fā)現(xiàn)小鼠經(jīng)ESAT6-Ag85B 融合DNA 疫苗和BCG 免疫后小鼠在MTB 小劑量氣霧攻擊28 d后，有相似的肺部病理指標(biāo)和荷菌量，而在生存實(shí)驗(yàn)中，兩者死亡的平均時(shí)間沒(méi)有明顯差別。

郝牧等［22］發(fā)現(xiàn)IL-12 與ESAT6 基因聯(lián)合免疫，較單獨(dú)的ESAT6 基因免疫，可刺激機(jī)體產(chǎn)生更加強(qiáng)烈而穩(wěn)定的細(xì)胞免疫應(yīng)答。IL-12 與ESAT6 聯(lián)合免疫時(shí)使用劑量是ESAT6 單獨(dú)免疫時(shí)的一半，但誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)卻明顯強(qiáng)于ESAT6 單獨(dú)免疫，并與BCG 免疫相當(dāng)。范雄林等以ESAT6 為基礎(chǔ)的DNA疫苗與BCG 聯(lián)合應(yīng)用證實(shí)，BCG 缺失而MTB 特異表達(dá)的蛋白可以異源性增強(qiáng)免疫，進(jìn)一步的研究說(shuō)明以BCG 缺失基因?yàn)榛A(chǔ)的融合蛋白DNA 疫苗可以增強(qiáng)BCG 初免小鼠和?？筂TB 感染的保護(hù)性［23-25］。LI［26］等通過(guò)Ag85A-ESAT6 嵌合DNA 疫苗初免，再用Ag85A 和ESAT6 蛋白加強(qiáng)免疫，結(jié)果發(fā)現(xiàn)聯(lián)合免疫引起了更高的體液免疫反應(yīng)。其他研究也表明［27］，通過(guò)DNA 基礎(chǔ)免疫后蛋白加強(qiáng)免疫，能改進(jìn)抗原特異性細(xì)胞的免疫反應(yīng)，對(duì)抵抗結(jié)核桿菌感染有非常重要的作用。

2.4 活疫苗 活疫苗包括減毒活疫苗和基因重組活疫苗，是對(duì)MTB 或BCG 進(jìn)行改良以減少前者的致病力或提高后者的免疫保護(hù)效力。主要包括表達(dá)分枝桿菌T 細(xì)胞抗原的重組活疫苗，表達(dá)細(xì)胞因子的重組BCG，MTB 營(yíng)養(yǎng)缺陷型突變株，MTB 減毒活疫苗或其他的弱毒及無(wú)毒分枝桿菌活菌苗，研制的關(guān)鍵是希望其免疫原性和安全性能取代BCG 的初種疫苗。

基因重組活疫苗:是利用基因工程技術(shù)將外源基因?qū)敕种U菌或其他活細(xì)菌，活病毒中，依靠細(xì)菌病毒在宿主內(nèi)復(fù)制，表達(dá)外源抗原，以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的體液和細(xì)胞免疫，使表達(dá)細(xì)胞因子的重組BCG 的免疫原性增強(qiáng)?；蚬こ叹呙绮粌H具備佐劑和載體功能同時(shí)又具有多種外源抗原與活疫苗作用，一次接種可獲得強(qiáng)而持久的特異性免疫。研究發(fā)現(xiàn)表達(dá)ESAT6 的重組腺病毒疫苗可增強(qiáng)感染小鼠肺部結(jié)核桿菌的清除率，減少特異性炎癥病灶的程度，并改變了肉芽腫的細(xì)胞組成［28］?，F(xiàn)已有幾種結(jié)核病基因重組活疫苗進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段［29-30］。

2.5 抗結(jié)核轉(zhuǎn)基因植物疫苗 轉(zhuǎn)基因植物疫苗是用轉(zhuǎn)基因方法將外源保護(hù)性抗原基因?qū)肟墒秤弥参锘蚪M中，并在在植物中穩(wěn)定表達(dá)和積累，人類和動(dòng)物通過(guò)食用而達(dá)到免疫和接種的目的。植物作為生物反應(yīng)器能有效地進(jìn)行翻譯后加工;而且利用植物生產(chǎn)疫苗蛋白易口服、成本低、安全性好，轉(zhuǎn)基因植物只表達(dá)組分疫苗，不含致病或潛在致病的微生物，對(duì)人畜安全［31］。通過(guò)轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)結(jié)核桿菌口服疫苗，不但可以改變傳統(tǒng)疫苗的生產(chǎn)方式和接種手段，還會(huì)大幅度降低疫苗的生產(chǎn)成本，具有潛在的社會(huì)意義和經(jīng)濟(jì)效益。

張更林等［32］將結(jié)核桿菌分泌蛋白ESAT6 基因，進(jìn)行了修飾改造，構(gòu)建了植物表達(dá)載體和根癌農(nóng)桿菌工程菌，采用葉盤(pán)法轉(zhuǎn)化熱帶水果番木瓜，成功的獲得了表達(dá)ESAT6 的轉(zhuǎn)基因番木瓜。李君武等［33］成功構(gòu)建了玉米特異啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)下結(jié)核HSP65 與ESAT－6 融合基因表達(dá)載體，為成功研制轉(zhuǎn)基因植物并生產(chǎn)抗結(jié)核口服疫苗奠定了基礎(chǔ)。目前利用轉(zhuǎn)基因植物生產(chǎn)病原微生物亞單位疫苗，還有外源基因在植物中的表達(dá)量和轉(zhuǎn)基因植物疫苗的生物安全性、免疫原性和免疫耐受等問(wèn)題有待解決［34］。

綜上所述，ESAT6 蛋白具有高度特異性和免疫活性，不僅是抗結(jié)核免疫的靶抗原，還是結(jié)核桿菌感染記憶免疫應(yīng)答的主要抗原。通過(guò)重組BCG 疫苗、DNA 疫苗、亞單位疫苗以及活疫苗等的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已初步顯示出較好的免疫效果，但是這些疫苗的有效性和安全性還值得進(jìn)一步驗(yàn)證，有必要建立一種更為有效的體內(nèi)外疫苗評(píng)價(jià)模型，同時(shí)也需建立一種簡(jiǎn)單、有效的免疫學(xué)檢測(cè)方法用于這些疫苗的效果評(píng)價(jià)。盡管很多候選疫苗已經(jīng)陸續(xù)進(jìn)入了臨床試驗(yàn)，但其離真正成為能夠廣泛應(yīng)用的疫苗還有很長(zhǎng)的路要走。我們相信，在全世界科學(xué)家的共同努力下，人們一定能夠攻克結(jié)核疫苗研究的難關(guān)，研制出安全、有效、經(jīng)濟(jì)的新型結(jié)核疫苗，并制定出合理的疫苗接種方案。

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